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正文內(nèi)容

基因工程載體-噬菌體載體(編輯修改稿)

2024-10-08 21:10 本頁面
 

【文章內(nèi)容簡介】 單鏈 DNA噬菌體的復(fù)制,是以雙鏈環(huán)形的 DNA為媒介的,這種復(fù)制形式 的 DNA簡稱 RFDNA; 2. 不論是 RFDNA還是 ssDNA都能感染大腸桿菌; 3. 單鏈 DNA噬菌體顆粒的大小,是受其 DNA的多制約的,不存在包裝限制 問題; 4. 容易測定外源 DNA片斷的插入取向; 5. 可產(chǎn)生含外源片斷的單鏈 DNA分子。 3. M13噬菌體 噬菌體 正鏈 復(fù)制 復(fù)制型 DNA 經(jīng) pII蛋白 造缺口 3′ 5′ 經(jīng) pII 蛋白 剪切 釋出單鏈 DNA(正鏈 ) 進(jìn)入下 一循環(huán) 5′ 3′ 3′ 5′ 滾環(huán)復(fù)制 在細(xì)菌內(nèi)的復(fù)制模式圖 M13噬菌體幾個重要特點(diǎn) : 1. M13噬菌體 不溶解 宿主細(xì)胞,只是 降 低 宿主細(xì)胞的生長速度。 2. M13噬菌體能以 單鏈 和 雙鏈 兩種方式存在,因此可以用 感染 (經(jīng)包裝的單鏈 DNA)和 轉(zhuǎn)化 (雙鏈 DNA)。 3. 克隆的外源基因片段不宜大于 1000bp。 M13噬菌體載體 M13是一種含單鍵( +) DNA( ssDNA)的絲狀大腸桿菌噬菌體,其基因組大小為 。這類載體主要用來獲得大量的單鏈DNA片段,這種單鏈DNA片段在遺傳學(xué)研究中主要用來測定DNA序列( sanger雙脫氧法)、基因的定點(diǎn)突變研究、異源雙鏈 DNA的分析等。 M13噬菌體的特點(diǎn) ?感染 Ecoli后,在宿主細(xì)胞內(nèi)會形成雙鏈的復(fù)制型DNA( replication form DNA, RF DNA)。可以象質(zhì)粒DNA那樣在體外進(jìn)行純化和操作。 ?成熟的噬菌體顆粒僅能感染 F+細(xì)胞,這是因?yàn)檫@種噬菌體的感染位點(diǎn)在性散毛上。但是無論是 RF DNA或 ss DNA都能轉(zhuǎn)染 F+或 F細(xì)胞。 ?噬菌體顆粒的大小是受其DNA的大小制約的,這一點(diǎn)正好與 λ 噬菌體相反。所以 M13噬菌體并不存在包裝限制的問題。 M13單鏈DNA噬菌體的生命周期 RF DNA Phage M13 replication in the host cell: + RNA pol DNA polIII 177。 RF Nicked by gene 2 protein + ssRolling circle replication, then cut and ligate Coated with gene 5 protein Gene 5 protein is replaced by gene 8 protein ect. Linear M13 phagereleased from the cell. (二) M13載體的構(gòu)建 ( 1)克隆區(qū)域的選定 ① 基因間隔區(qū)( intergenic region, IG區(qū)) J. Messing證明, IG區(qū)存在M13的復(fù)制起點(diǎn),但可以插入外源 DNA而不影響 M13噬菌體的活力。 在 IG區(qū)內(nèi)插入一個大腸桿菌的 LacZ’( ?肽序列 )。 利用 ?肽序列中的三個單一酶切位點(diǎn)( Bgl II、 Ava II 和 Pvu I)。 (2)加入酶切位點(diǎn) ① 在 IG區(qū)內(nèi)加入單一內(nèi)切酶位點(diǎn) 第一個 M13載體: M13mp1: M13 RF BsuI不完全消化 各種長度的線性片斷 (其中應(yīng)有只在IG上切開的線性全長 M13) lac基因的HindII片斷 (lacI、lacP、 lacO、 lacZ’) 連接 M13mp1 JM101宿主 只有在 IG區(qū)插入 lacZ’才能存活并在 Xgal上出現(xiàn)互補(bǔ)的藍(lán)噬菌斑 (三) M13系列載體的優(yōu)點(diǎn) 1) 有 MCS,便于克隆不同的酶切片段 2) Xgal顯色反應(yīng),可供直接選擇 3)無包裝限制,克隆能力大 4)可以克隆雙鏈 DNA分子中的每一條鏈 子代 M13噬菌體中包含的是單鏈 +DNA。 (四) M13噬菌體用途 : 1) DNA序列測定; 2) 制備單鏈 DNA探針; 3) 用于定點(diǎn)突變的研究。 M13載體 ? 具有多克隆位點(diǎn) (MCS),方便克隆。許多 M13載體的多克隆位點(diǎn)與質(zhì)粒載體 pUC序列的多克隆位點(diǎn)是相同的,在克隆位點(diǎn)選
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