基因工程載體-噬菌體載體(編輯修改稿)
2024-10-08 21:10 本頁面
【文章內(nèi)容簡介】 單鏈 DNA噬菌體的復(fù)制，是以雙鏈環(huán)形的 DNA為媒介的，這種復(fù)制形式 的 DNA簡稱 RFDNA； 2. 不論是 RFDNA還是 ssDNA都能感染大腸桿菌； 3. 單鏈 DNA噬菌體顆粒的大小，是受其 DNA的多制約的，不存在包裝限制 問題； 4. 容易測定外源 DNA片斷的插入取向； 5. 可產(chǎn)生含外源片斷的單鏈 DNA分子。 3. M13噬菌體 噬菌體 正鏈 復(fù)制 復(fù)制型 DNA 經(jīng) pII蛋白 造缺口 3′ 5′ 經(jīng) pII 蛋白 剪切 釋出單鏈 DNA(正鏈 ) 進(jìn)入下 一循環(huán) 5′ 3′ 3′ 5′ 滾環(huán)復(fù)制 在細(xì)菌內(nèi)的復(fù)制模式圖 M13噬菌體幾個重要特點(diǎn) ： 1. M13噬菌體 不溶解 宿主細(xì)胞，只是 降 低 宿主細(xì)胞的生長速度。 2. M13噬菌體能以 單鏈 和 雙鏈 兩種方式存在，因此可以用 感染 (經(jīng)包裝的單鏈 DNA)和 轉(zhuǎn)化 (雙鏈 DNA)。 3. 克隆的外源基因片段不宜大于 1000bp。 M13噬菌體載體 M13是一種含單鍵（ +） DNA（ ssDNA）的絲狀大腸桿菌噬菌體，其基因組大小為 。這類載體主要用來獲得大量的單鏈ＤＮＡ片段，這種單鏈ＤＮＡ片段在遺傳學(xué)研究中主要用來測定ＤＮＡ序列（ sanger雙脫氧法）、基因的定點(diǎn)突變研究、異源雙鏈 DNA的分析等。 M13噬菌體的特點(diǎn) ?感染 Ecoli后，在宿主細(xì)胞內(nèi)會形成雙鏈的復(fù)制型ＤＮＡ（ replication form DNA, RF DNA）。可以象質(zhì)粒ＤＮＡ那樣在體外進(jìn)行純化和操作。 ?成熟的噬菌體顆粒僅能感染 F+細(xì)胞，這是因?yàn)檫@種噬菌體的感染位點(diǎn)在性散毛上。但是無論是 RF DNA或 ss DNA都能轉(zhuǎn)染 F+或 F細(xì)胞。 ?噬菌體顆粒的大小是受其ＤＮＡ的大小制約的，這一點(diǎn)正好與 λ 噬菌體相反。所以 M13噬菌體并不存在包裝限制的問題。 M13單鏈DNA噬菌體的生命周期 RF DNA Phage M13 replication in the host cell: + RNA pol DNA polIII 177。 RF Nicked by gene 2 protein + ssRolling circle replication, then cut and ligate Coated with gene 5 protein Gene 5 protein is replaced by gene 8 protein ect. Linear M13 phagereleased from the cell. （二） M13載體的構(gòu)建 （ 1）克隆區(qū)域的選定 ① 基因間隔區(qū)（ intergenic region, IG區(qū)） J. Messing證明， IG區(qū)存在M13的復(fù)制起點(diǎn)，但可以插入外源 DNA而不影響 M13噬菌體的活力。 在 IG區(qū)內(nèi)插入一個大腸桿菌的 LacZ’（ ?肽序列 )。 利用 ?肽序列中的三個單一酶切位點(diǎn)（ Bgl II、 Ava II 和 Pvu I）。 (2)加入酶切位點(diǎn) ① 在 IG區(qū)內(nèi)加入單一內(nèi)切酶位點(diǎn) 第一個 M13載體： M13mp1： M13 RF BsuI不完全消化 各種長度的線性片斷 （其中應(yīng)有只在IG上切開的線性全長 M13） lac基因的HindII片斷 (lacI、lacP、 lacO、 lacZ’） 連接 M13mp1 JM101宿主 只有在 IG區(qū)插入 lacZ’才能存活并在 Xgal上出現(xiàn)互補(bǔ)的藍(lán)噬菌斑 （三） M13系列載體的優(yōu)點(diǎn) 1） 有 MCS，便于克隆不同的酶切片段 2） Xgal顯色反應(yīng)，可供直接選擇 3）無包裝限制，克隆能力大 4）可以克隆雙鏈 DNA分子中的每一條鏈 子代 M13噬菌體中包含的是單鏈 +DNA。 （四） M13噬菌體用途 ： 1） DNA序列測定； 2） 制備單鏈 DNA探針； 3） 用于定點(diǎn)突變的研究。 M13載體 ? 具有多克隆位點(diǎn) (MCS)，方便克隆。許多 M13載體的多克隆位點(diǎn)與質(zhì)粒載體 pUC序列的多克隆位點(diǎn)是相同的，在克隆位點(diǎn)選
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