用于基因克隆的載體(編輯修改稿)
2025-05-29 13:47 本頁面
【文章內(nèi)容簡介】 ② 選擇方便 Xgal顯色、抗菌素雙重直接選擇。 ③ 克隆便利 具有多克隆位點（ MCS）。 ④ 測序方便 （ 5） pUC系列載體的優(yōu)點 . pGEM3Z 由 pUC派生而來 ,與 pUC的主要區(qū)別是在 MCS的兩側分別加了一個噬菌體 啟動子 T7和 SP6。 T7啟動子 SP6啟動子 MCS lacZ’ Ampr ori 可被 T7和 SP6的 RNA聚合酶識別轉錄。 ① 如果加入純化的 T7或 SP6 RNA聚合酶，在試管里就可以轉錄 mRNA ② 外源基因正接反接都可以轉錄。 ③ MCS與 pUC18的完全一樣。 pGEM3Z的特點： . PMD18T . PMD18T 噬菌體或病毒 DNA 噬菌體或病毒是一類非細胞微生物，能高效高特異性地侵染宿主細胞，然后或自主復制繁殖，或整合入宿主基因組中潛伏起來，而且在一定的條件下上述兩種狀態(tài)還會相互轉化。噬菌體或病毒的上述特性使它們的 DNA能被開發(fā)成為基因工程的有用載體，因為： 高效的感染性能使外源基因高效導入受體細胞 自主復制繁殖性能使外源基因在受體細胞中高效擴增 噬菌體的生物學特性： 生物結構 λ 噬菌體是大腸桿菌的溫和型噬菌體 λ 噬菌體由外殼包裝蛋白和 λ DNA組成 λ DNA全長 48502個核苷酸 λ DNA上至少有 61個基因 l 噬菌體生物學特性： 生物結構 5’ TCCAGCGGCGGGG 3’ 3’ CCCGCCGCTGGA 5’ COS COS cos 頭部合成基因 尾部合成基因 溶菌控制基因 晚期控制基因 DNA合成控制 基因 阻遏基因 早期控制基因 阻遏基因 重組基因 刪除與整合基因 l DNA l 噬菌體生物學特性： 溶菌周期 吸附 LamB受體 注入 復制 包裝 裂解 l 噬菌體生物學特性：溶菌周期 體內(nèi)包裝 100個左右的拷貝 包裝范圍為原 DNA的 75 105% 即 36 51 kb D A l 噬菌體生物學特性： 溶原狀態(tài) l噬菌體感染大腸桿菌后 ， 除能裂解細胞外 ，也可能將其 DNA直接整合到宿主細胞的染色體DNA上 ， 并不產(chǎn)生子代噬菌體顆粒 ， 這種情況為溶原狀態(tài) 。 DNA重組技術一般需要 l噬菌體進入溶菌狀態(tài) 。 l噬菌體感染細菌的早期：雙鏈進行 ?型復制。 lDNA的復制 模型 （ 1） ?型復制 （ 2）滾環(huán)復制 感染的晚期：啟動滾環(huán)復制機制。 形成多聯(lián)體 lDAN分子。 這種多聯(lián)體分子必須在 cos位點被切斷成單體分子才能被包裝起來。 （ 1）構建原理： . l噬菌體載體的構建 （ 2）構建過程 ① 在這個非必須區(qū)內(nèi)制造限制酶切點 ② 引進某些突變表型，作為選擇標記 ③ 突變某些基因，使它成為安全載體 ④ 刪除 lDNA必須區(qū)段上常用的限制酶切點 刪除 l噬菌體的非必需區(qū)，留出插入空間。 （ 3） 人工構建的 l噬菌體載體有兩種類型： ① 插入型載體（ insertion vectors)： 如 lgt lgt1 lBV lNM5lNM1590、 lNM607 1）免疫功能失活型： 插入位點位于載體合成活性阻遏物區(qū)域（ cI基因）內(nèi)。 EcoR I cI lgt10 插入導致載體不能合成阻遏物， l載體 DNA不能進入溶源期，受體菌全部裂解，形成清晰的噬菌斑。 沒有外源 DNA插入的 l載體感染受體菌形成混濁噬菌斑。 選擇標記 : 如 lNM1149載體的兩個克隆位點（ EcoR I 和Hind III）都是位于 cI基因內(nèi)部。 2） ?半乳糖苷酶失活型載體： 在 l基因組中引入了 LacZ’序列。（其上含有一個 EcoR I 克隆位點）。 感染 LacZ突變的大腸桿菌，經(jīng) IPTG的誘導，利用 Xgal的顯色反應作選擇標記。 LacZ’ EcoR I Charon16A 選擇標記 : ② 替換型載體（ substitution vectors) 兩個多克隆位點區(qū)以反向重復形式分別位于lDNA的非必須區(qū)兩端。 用酶切后，可以將中間的區(qū)段切下來，與用同樣酶切成的外源 DNA片斷置換。 可置換區(qū) MCS MCS 如： l EMBL Charon40等。 1） l EMBL4 l EMBL4的可置換片斷內(nèi)部還有 Sal I酶切位點。 以便于進一步消化中間片斷，防止自我連接。 左臂 可置換區(qū) 右臂 EcoR I BamH I Sal I Sal I BamH I EcoR I Sal I Sal I lEMBL4 2） Charon40 Charon40的可置換片斷是由 DNA短片重復構成，片斷之間有 Hae I 切點。 在克隆的時候，可以用 Hae I 酶進一步將可置換片斷切成小片斷，以防止重新與載體連接。 左臂 可置換區(qū) 右臂 MCS MCS Charon40 Hae I 可取代片斷中如果包含 LacZ’，可用 Xgal顯色作篩選標記。 （ 4） l載體的篩選標記 ② 插入型載體 根據(jù)插入所引起的表型突變。 ① 置換型載體 l DNA象質(zhì)粒載體那樣直接轉化細菌時效率遠比質(zhì)粒低。 l載體的體外包裝 在試管中與 l噬菌體的頭部和尾部蛋白人工裝配成噬菌體顆粒，才能高效地感染細菌，把重組 DNA注入受體菌中。 （ 1）體外包裝： l 的 D基因的產(chǎn)物也是頭部蛋白，但主要與 l DNA 進入頭部和頭部的成熟有關（只占 20%）。 （ 2）體外包裝過程 ① l噬菌體外殼蛋白的合成 E 基因 l的 E 基因編碼頭部蛋白的主要成分（占頭部總蛋白的 70%）。 D基因 E基因突變 只合成尾部蛋白和包裝識別蛋白 D基因突變 合成頭部蛋白和尾部蛋白，但不能聚合和包裝DNA 提取尾部蛋白 提取頭部和尾部蛋白 重組的 l載體 DNA 體外包裝成活性噬菌體 外源的重組 lDNA載體被誘發(fā)與內(nèi)源性原 lDNA發(fā)生重
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