目的基因的分離和克隆(編輯修改稿)
2025-06-19 23:55 本頁面
【文章內(nèi)容簡介】 RNA中拷貝數(shù)大于基因組中的拷貝數(shù) , 利于獲得較多的模板。（轉(zhuǎn)錄特征） 4. 可在原核細胞中表達有生物活性蛋白 5. 不同種類不同狀態(tài)的細胞的 cDNA文庫不同 6. 不能研究基因組的結(jié)構(gòu)功能 構(gòu)建 cDNA文庫 mRNA 1)取材： mRNA約占總 RNA的 1－ 5％，所以應(yīng)選用目的基因 mRNA表達最豐富的組織細胞為材料來源，如獲胰島素基因，由應(yīng)以胰島 β細胞為原始生物材料，細胞因子基因應(yīng)選用經(jīng)抗原或絲裂原刺激培養(yǎng)的淋巴細胞為材料 2)從總的 RNA中分離 mRNA 將提取的 mRNA在寡聚脫氧胸苷酸 [ oligo(dT) ] 纖維素中進行 親和層析 cDNA合成 1）以 Oligo(dT) 為引物：從模板 3’末端開始，沿模板的 3’→5’ 方向合成 , 對于較長的 mRNA分子很難得到全長 cDNA 2）隨機引物：以 6～ 8個核苷酸為隨機引物，從mRNA的不同結(jié)合點合成全長 cDNA第一鏈（ RNADNA） cDNA的合成 ⑴ 自身引導(dǎo)法： ⑵ 置換合成法 ⑶ 外加引物合成法 導(dǎo)入宿主細胞 (如圖 45) 篩選目的基因 ⑴ 核酸雜交法 特殊標(biāo)記的寡核苷酸鏈為探針 將擴增好的 cDNA文庫（即許多帶有 cDNA重組體大腸桿菌培養(yǎng)皿內(nèi)所形成的菌落或噬菌斑）轉(zhuǎn)印到硝酸纖維素膜上，堿解后加帶標(biāo)記的探針進行雜交，能顯示特異結(jié)合探針的點（克隆）便是目的基因所在處。確定菌落或噬菌斑的位置，擴增，提取，再用限制性酶切出 cDNA基因片斷，即為目的基因。 （如圖） ? ⑵ 免疫結(jié)合法 ? 噬菌斑轉(zhuǎn)印到硝酸纖維膜上，各種 cDNA表達并呈現(xiàn)在噬菌體表面的蛋白質(zhì)便牢固地結(jié)合在膜上。然后將膜放入含有特異抗體的溶液中進行免疫結(jié)合反應(yīng)，洗去未結(jié)合的抗體后，再與 125 I 標(biāo)記的第二抗體結(jié)合 , 從而找出帶有放射性示蹤信號的斑點 , 進而找出對應(yīng)噬菌斑 , 克隆擴增 , 提取 DNA后經(jīng)酶切可獲目的基因。 獲得目的基因的其他方法 ㈠ 構(gòu)建差示文庫篩選特殊基因 差示文庫（ differential library）又稱扣除文庫（ subtracted library） , 是反映不同組織細胞或同一種細胞在不同生理狀態(tài)下 ,基因表達差異的 cDNA文庫。 ㈡ mRNA差異顯示法 獲得目的基因 mRNA差異顯
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