目的基因的獲取ppt課件(編輯修改稿)
2025-02-11 05:38 本頁面
【文章內(nèi)容簡介】 TTTT5’ 四、依據(jù)基因部分序列信息獲得基因全長序列 反向 PCR (inverse PCR, IPCR) 盒式 PCR RACE技術(shù) ? 反向 PCR：根據(jù)已知 DNA區(qū)的序列設(shè)計(jì)引物，以包含已知區(qū)和未知區(qū)的環(huán)化 DNA分子為模板來擴(kuò)增未知DNA區(qū)序列的 PCR技術(shù)。 RE 已知區(qū)域 RE 酶切酶連 引物 A S1 引物 A S2 克隆測序 ? 盒式 PCR：是利用 cassete（即人工合成的帶有適當(dāng)限制酶的粘性末端較長的雙鏈 DNA分子）和cassete上的引物，特異性擴(kuò)增目的基因組 DNA未知區(qū)域的一種有效方法。 ? RACE技術(shù)：通過 PCR技術(shù)進(jìn)行 cDNA末端快速克隆的技術(shù)。以 mRNA為模板逆轉(zhuǎn)錄成 cDNA第一條鏈后，用 PCR技術(shù)擴(kuò)增出某個(gè)特異位點(diǎn)到 3’或 5‘之間的未知序列的方法，分別稱 3’RACE或 5‘RACE。 第三節(jié) 篩選基因文庫獲取目的基因 一、基因組文庫的構(gòu)建 二、 cDNA文庫的構(gòu)建 三、篩選基因文庫獲取目的基因 ? 基因文庫（ gene library） 通過克隆的方法將某一基因組 DNA或 cDNA保存于適當(dāng)宿主菌或噬菌體中形成轉(zhuǎn)化子群，所有重組 DNA序列總和代表該基因組的 DNA全部或部分序列。 ?基因文庫的完備性 ?指在構(gòu)建的基因文庫中任一基因存在的概率。 ?它與基因文庫最低所含克隆數(shù) N之間的關(guān)系如下： N = ln ( 1 – P ) / ln ( 1 – f ) P = 任一基因被克隆的概率 f = 克隆片段的平均大小 生物基因組的大小 ?例如：人的單倍體 DNA總長為 x 109 bp，基因文庫中克隆片段的平均大小為 15 kb， 則構(gòu)建一個(gè)完備性為 45萬個(gè)克隆；而當(dāng)完備性提高到 ，基因文庫至少需要 180萬個(gè)克隆。 For example : 期望值為 ，插入片斷為 20kb的 ( 106 bp) 和 human (3 109 bp) 基因組的克隆數(shù)的計(jì)算 N = = 103 ln( ) ln[1(2 104/ 106)] Nhuman= = 105 ln() ln[1(2 104/3 109)] 一、基因組文庫 （ genomic library） 的構(gòu)建 ：將某一生物基因組 DNA片段化并全部克隆后所獲得的重組子群體的總稱。 ? 重組克隆總數(shù)不可過大； ? 克隆基因的完整性； ? 部分重疊序列大小合適； ? 克隆片段易于從載體上卸載； ? 重組克隆能穩(wěn)定保存擴(kuò)增篩選。 1)基因組 DNA的制備 原則：完整性好、純度高。 A A A A 2）基因組 DNA的片斷化 ? 限制性內(nèi)切酶酶切 —— 部分酶切 ? 物理方法：超聲波處理、小孔噴射、高速攪拌 3）載體和受體的選擇 載體 承載片段大小 受體 plasmid 15kb 大腸桿菌 λ DNA 23kb λ 噬菌體 cosmid 45kb 大腸桿菌 YAC 1000kb 酵母菌 4） DNA片斷和載體的連接 ? 黏性末端連接效率比平末端高 ? 定向連接可以提高重組率 ? 防止載體自連 5）重組體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞 至此，建成了基因組文庫的初庫 6）初庫的擴(kuò)增 初庫經(jīng)過擴(kuò)增形成終庫。 二、 cDNA文庫 (plementary DNA library)的構(gòu)建 cDNA
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