【文章內(nèi)容簡介】 子及早期的胚胎細(xì)胞。 ? 這一方法技術(shù)簡單，一般易于掌握，且能避免體細(xì)胞變異等問題，故有一定的應(yīng)用前景。 重組 DNA分子導(dǎo)入哺乳動物細(xì)胞 ? 病毒種類多樣及病毒 DNA或 RNA構(gòu)建的載體性質(zhì)的各異，所以轉(zhuǎn)導(dǎo)的過程各不相同，主要有三種類型： ? 一，帶有目的基因的病毒顆粒直接感染受體細(xì)胞，目的基因隨同病毒 DNA分子整合到受體細(xì)胞染色體 DNA上，這樣以后不需要再包裝成病毒顆粒。 ? 二，帶有目的基因的毒病是缺陷性的，須同另一輔助病毒一起感染受體細(xì)胞．在受體細(xì)胞內(nèi)包裝成新的病毒顆粒。 ? 三，雖然帶目的基因的 SV40病毒是早期轉(zhuǎn)錄缺陷型的，但被感染的 COS細(xì)胞系的基因組中整合有 SV40早期轉(zhuǎn)錄區(qū)段 DNA，所以沒有必要用輔助病毒作混合感染。 ① 病毒顆粒轉(zhuǎn)導(dǎo)法 ② 磷酸鈣轉(zhuǎn)染法 ? 其依據(jù)是哺乳動物細(xì)胞能捕獲黏附在細(xì)胞表面的 DNA磷酸鈣沉淀物，使 DNA轉(zhuǎn)入細(xì)胞。 ? DNA磷酸鈣共沉淀復(fù)合物中 DNA的數(shù)量、共沉淀物與細(xì)胞接觸的保溫時間、以及 DMSO和甘油等促進因子作用的持續(xù)時間均會影響 DNA的轉(zhuǎn)染效率。 ③ DEAE葡聚糖轉(zhuǎn)染法 ? 二乙胺乙基葡聚糖 (DEAE)是一種高分子質(zhì)量的多聚陽離子試劑，能促進哺乳動物細(xì)胞捕獲外源 DNA，實現(xiàn)短時間的有效表達。 ? 目前有關(guān) DEAE葡聚糖的作用機制一般認(rèn)為 DEAE葡聚糖能與外源 DNA形成復(fù)合物，保護 DNA免受核酸酶的降解；其次是 DEAE葡聚糖可作用于受體細(xì)胞膜，增加其通透性，便于 DNA進入。 ? 此方法簡單、重復(fù)性高，并且轉(zhuǎn)染效率高于磷酸鈣法。 ④ 聚陽離子 DMSO轉(zhuǎn)染法 ? 采用聚陽離子 polybrene處理哺乳動物細(xì)胞，增加細(xì)胞表面對 DNA的吸附能力、然后再用 25％ 30％ DMSO短暫處理細(xì)胞，增加膜的通透性，提高對 DNA的捕獲量。 ⑤ 顯微注射轉(zhuǎn)基因技術(shù) ? 應(yīng)用顯微注射器可以把重組 DNA直接注入哺乳動物細(xì)胞。 ? 用此方法轉(zhuǎn)基因的效率很高。獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)化子的數(shù)量取決于注射的 DNA的性質(zhì)。 ⑥ 電穿孔 DNA轉(zhuǎn)移技術(shù) ? 原理同植物的電穿孔轉(zhuǎn)移 DNA法。 ? 在電脈沖處理之前，先用乙酰甲基秋水仙堿預(yù)處理細(xì)胞 10h，可提高轉(zhuǎn)化效率 310倍。這很可能是由于預(yù)處理導(dǎo)致中期停頓的細(xì)胞中，細(xì)胞核處于無膜狀態(tài)，或者核膜具有較高的通透性所致。 ⑦ 脂質(zhì)體介導(dǎo)法 ? 利用脂質(zhì)體介導(dǎo)法將外源 DNA導(dǎo)入哺乳動物細(xì)胞具有實用潛力。 ? 由于脂質(zhì)體具有無毒、無免疫原性的特點，不僅可用于體外受體細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)化，而且可以在動物體內(nèi)將基因轉(zhuǎn)入肝細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞等靶細(xì)胞或靶組織、靶器官位點，實現(xiàn)瞬間表達或穩(wěn)定表達，成為基因治療的一種有效工具。 重組子的篩選 克隆子的篩選 ? 概念 ?克隆子 ?轉(zhuǎn)化子 ?重組子 ? 將攝取外源 DNA分子并能使該分子在其中穩(wěn)定維持的受體細(xì)胞統(tǒng)稱為 克隆子 。 ? 把采用各種轉(zhuǎn)化方法或轉(zhuǎn)導(dǎo)方法獲得的克隆子叫做 轉(zhuǎn)化子（ 導(dǎo)入外源 DNA分子后能穩(wěn)定存在的受體細(xì)胞稱為 轉(zhuǎn)化子 ） ，現(xiàn)在這兩者有通用的趨向。 ? 含有重組 DNA分子的克隆子被稱為 重組子， 如果重組子中含有外源目的基因則又稱為 陽性克隆子 或期望重組子 。 ? 在重組 DNA分子的轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中，一般僅有少數(shù)受體細(xì)胞成為克隆子。必須采用合適的方法從大量的細(xì)胞背景中篩選出期待的克隆子 。 ? 經(jīng)過各種方法將外源 DNA分子導(dǎo)入受體細(xì)胞后，獲得所需陽性克隆子的過程稱為 克隆子的篩選。 ? 根據(jù)載體選擇標(biāo)記初步篩選轉(zhuǎn)化子 ? 在構(gòu)建基因工程載體系統(tǒng)時，通常在載體 DNA分子中組裝了一種或兩種選擇標(biāo)記基因，在受體細(xì)胞內(nèi)進行表達，呈現(xiàn)出特殊的表型或遺傳學(xué)特性，作為 篩選轉(zhuǎn)化子的依據(jù) 。 ? 一般的做法 是將轉(zhuǎn)化處理后的受體細(xì)胞接種在合適量選擇藥物的培養(yǎng)基上，在最適生長溫度條件下培養(yǎng)一定時間，根據(jù)菌落生長情況挑選出轉(zhuǎn)化子。 ? 常用的 選擇標(biāo)記基因 主要是抗性基因以及表達產(chǎn)物可以發(fā)光或使反應(yīng)底物顯色的基因，相應(yīng)的選擇條件是可以被抗性基因產(chǎn)物分解的抗生素和除草劑，可以使基因產(chǎn)物發(fā)光的光線，或者是可以使基因產(chǎn)物顯色的試劑。 ? 選擇培養(yǎng)基 是根據(jù)宿主細(xì)胞類型配置的培養(yǎng)基，對于細(xì)菌受體細(xì)胞而言，通常用 LB培養(yǎng)基，在 LB培養(yǎng)基中加入適量的某種選擇物．即為選擇培養(yǎng)基。 選擇物 是由載體 DNA分子上攜帶的選擇標(biāo)記基因所決定。 （ 1）抗藥性篩選 （ 2）插入失活篩選法 （ 3）插入表達篩選法 ? 利用外源目的基因插入特定載體后能激活篩選標(biāo)記基因的表達，由此進行轉(zhuǎn)化子的篩選。 ? 有些載體在設(shè)計時，在篩選標(biāo)記基因前面連接上一段負(fù)調(diào)控序列，當(dāng)插入失活該負(fù)調(diào)控序列時，其下游的篩選標(biāo)記基因才能表達。 ? 例如 pTR262質(zhì)粒載體，它由 pBR322衍生而來，其 Tcr基因的上游含有一段 λ 噬菌體 DNA的 CI阻遏蛋白編碼基因及其調(diào)控序列， CI基因表達的阻遏蛋白可以抑制 Tcr基因的表達。當(dāng)外源 DNA片段插入 CI基因的 Hin dⅢ 或 Bgl Ⅰ 位點上時， CI基因失活． Tcr基因因阻礙解除而得以表達，故陽性重組子為 Tcr表型．而質(zhì)粒本身為 Tcs表型，當(dāng)轉(zhuǎn)化細(xì)菌涂布在 Tc平板上時，只有含有外源 DNA插入片段的陽性重組子的轉(zhuǎn)化菌才能生長成菌落。 （ 4）顯色互補篩選法 ? lacZ 基因上缺失操縱基因區(qū)段的突變體與帶有完整的近操縱基因區(qū)段的 β 半乳糖苷酶陰性突變體之間實現(xiàn)互補，這種互補現(xiàn)象稱為 α 互補 。 ? 具有完整乳糖操縱子的菌體能轉(zhuǎn)譯 β 半乳糖苷酶(Z)、 IPTG和 Xgal時，產(chǎn)生蘭色沉淀物，使菌落成為藍(lán)色。如果在載體 DNA上組入 β 半乳糖苷酶基因（ lacZ)部分缺失的片段 (lacZ’)．則重組 DNA分子轉(zhuǎn)化 lacZ’互補型菌落，會在含有 Xgal和IPTG的培養(yǎng)基中得到的轉(zhuǎn)化子是藍(lán)色菌落。 ? lac Z’是 β 半乳糖苷酶基因部分缺失的 DNA片段，含 lac Z’的重組載體轉(zhuǎn)化 lac Z’互補型菌株，可轉(zhuǎn)譯 β 半乳糖苷酶 ，在含有 Xgal（ 5溴 4氯 3吲哚 β D半乳糖苷）和 IPTG（異丙基 β 硫代半乳糖苷） 的培養(yǎng)基上使轉(zhuǎn)化子成為藍(lán)色菌落 ，而 lac Z’互補型菌株本身為白色菌落 。當(dāng) lac Z’區(qū)插入外源基因后，再轉(zhuǎn)化 lac Z’互補型菌株，由于不能翻譯 β 半乳糖苷酶，轉(zhuǎn)化子即使在含有X－ gal和 IPTG的培養(yǎng)基上也只能長成白色菌落。這樣可以區(qū)分含外源基因和不含外源基因的轉(zhuǎn)化子。 ? 此方法主要用于原核生物。 α 互補的檢測 ? 以顯色劑 xgal作為選擇物時， DNA對照組不應(yīng)出現(xiàn)任何菌落，感受態(tài)細(xì)胞對照組長出的菌落應(yīng)全是藍(lán)色的，感受態(tài)細(xì)胞有效性對照組長出的菌落中應(yīng)有白色的，其中一項不符，就有可能挑出假的轉(zhuǎn)化子菌落。 （ 5）利用報告基因篩選植物轉(zhuǎn)化細(xì)胞 ? 報告基因 ：系指其編碼產(chǎn)物能夠被快速地測定，常用來判斷外源基因是否已經(jīng)成功地導(dǎo)入寄主細(xì)胞（器官或組織）并檢測其表達活性的一類特殊用途的基因。 ? 在植物轉(zhuǎn)基因研究中，在有選擇壓力的情況下，可利用報告基因在受體細(xì)胞內(nèi)的表達，從大量非轉(zhuǎn)化克隆中選擇出轉(zhuǎn)化細(xì)胞；同時，報告基因可以和某些目的基因構(gòu)成嵌合基因，從報告基因的表達了解目的基因的表達情況及推測基因調(diào)控序列。常用的報告基因有抗生素抗性基因以及編碼某些酶類或其他持殊產(chǎn)物的基因等。 ? ① 新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因（ nptⅡ ）抗新霉素、卡那霉素、慶大霉素和 G418等抗生素，成為篩選動植物轉(zhuǎn)化子的選擇標(biāo)記基因。 ? ②潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因（ hpt）賦予轉(zhuǎn)化子能抗潮霉素，作為選擇標(biāo)記基因主要用于篩選動植物轉(zhuǎn)化子。潮霉素是致癌物質(zhì)，操作時應(yīng)慎重。 ? ③氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因（ cat）也被用于篩選動植物轉(zhuǎn)化子的標(biāo)記基因。 ④ β 葡萄糖酸酶基因（ gus） ? gus的基因產(chǎn)物 β 葡萄糖酸酶（ GUS）能夠催化 4甲基傘形花酮 β D葡萄糖苷酸， 產(chǎn)生熒光物質(zhì)4甲基傘形花酮，以此篩選含 gus基因的轉(zhuǎn)化子。 ? 由于植物細(xì)胞 GUS本底非常低，因此廣泛地應(yīng)用于篩選植物轉(zhuǎn)化子。 ? 尤其是 gus基因的 3’端與其他結(jié)構(gòu)基因連接產(chǎn)生的嵌合基因仍能正常表達，產(chǎn)生的融合蛋白中仍有GUS活性，可用于外源基因在轉(zhuǎn)化生物體中的定位分析。 ⑤ 螢火蟲熒光素酶基因（ luc） ? luc表達產(chǎn)物螢火蟲熒光素酶（ LUC）在 Mg2+的作用下， 可以與熒光素和 ATP底物發(fā)生反應(yīng)， 形成 與酶結(jié)合的 腺苷酸熒光素?；瘡?fù)合物， 經(jīng)過氧化脫羧作用后， 該復(fù)合物轉(zhuǎn)變成為處于激活狀態(tài)的氧化熒光素，可以用熒光測定儀快速靈敏地檢測出產(chǎn)生的熒光，是目前研究動植物轉(zhuǎn)基因很好用的一種報告基因。 ? Luc基因檢測十分迅速，靈敏度高，成本低，不存在放射性同位素檢測對人體健康和環(huán)境生態(tài)所造成的危害，也沒有內(nèi)源熒光產(chǎn)牛的背景干擾，因此， Luc是一種理想的報告基因。 ⑥ 抗除草劑 bar基因 ? bar基因編碼磷化乙酰轉(zhuǎn)移酶（ PAT），使轉(zhuǎn)化子對含有磷化麥黃酮（ PPT）成分的除草劑具有抗性。 ⑦ 冠癭堿合成酶基因 ? 主要包括 胭脂堿合成酶基因 和 章魚堿合成基因 兩類，存在于土壤農(nóng)桿菌 Ti質(zhì)粒的 TDNA區(qū)段。 ? 冠 癭 堿合成酶基因在植物細(xì)胞中的表達產(chǎn)物可以催化一些特殊反應(yīng)，通過電泳分離及菲醌熒光染料染色，方便地觀察，據(jù)此作為報告基因用于轉(zhuǎn)植物基因細(xì)胞的篩選。 ? 冠 癭 堿合成酶基因在植物基因工程早期應(yīng)用較多，現(xiàn)已逐漸被其他更為理想的報告基因所取代。 （ 6）利用遺傳選擇標(biāo)記篩選哺乳動物轉(zhuǎn)基因細(xì)胞 ? 在植物轉(zhuǎn)基因研究中采用的氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶 (Cat)基因和新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶 (NptⅡ) 基因也可用于哺乳動物轉(zhuǎn)基因細(xì)胞的篩選。 ? 常用的標(biāo)記基因還有： ? 胸腺核苷激酶基因（ tk）、 ? 二氫葉酸還原酶基因（ dhfr） ? 次黃嘌呤 鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶基因（ hgprt） ? 細(xì)菌的黃嘌呤 鳥嘌呤磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶基因(ecogpt)等。 ? 胸腺核苷激酶基因（ tk）、二氫葉酸還原酶基因（ dhfr）及次黃嘌呤 鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶基因（ hgprt）等的表達產(chǎn)物直接或間接參與核苷酸合成代謝。 ? 這些基因缺失的缺陷型細(xì)胞因核苷酸合成代謝失調(diào)而死亡，只有在添加某些核苷酸的培養(yǎng)基中才能生長。如果用這樣的缺陷型細(xì)胞作為受體細(xì)胞，導(dǎo)入含有這些基因的外源 DNA，補充原來缺失的基因，使核苷酸合成代謝恢復(fù)正常，可以在不添加核苷酸的培養(yǎng)基中正常生長。 ? 根據(jù)這一性質(zhì)可以在不添加核苷酸的培養(yǎng)基中篩選出轉(zhuǎn)化子。 ① 胸腺核苷激酶基因 ? 胸苷激酶 (TK)是核苷酸合成代謝途徑中的一種酶，能夠把胸苷轉(zhuǎn)換為胸苷 磷酸，保證核苷酸的順利合成。胸苷激酶的編碼基國 (tk)，幾乎在所有的真核細(xì)胞中都能有效地表達，因此可采用這種基因作為遺傳選擇記號以確定哺乳動物基因轉(zhuǎn)移．相應(yīng)的受體細(xì)胞為遺傳標(biāo)記遺傳表型的缺陷型。 轉(zhuǎn)基因動物細(xì)胞篩選方式： HAT選擇法 、 共轉(zhuǎn)化選擇法 ? HAT選擇法 ：由于選擇培養(yǎng)基中含有次黃嘌呤（ H）、氨基蝶呤（ A）和胸苷（ T），主要針對含有選擇標(biāo)記的目的基因轉(zhuǎn)化子的篩選。 ? 基本原理： 利用培養(yǎng)基中的葉酸類似物氨基蝶呤 (APT)阻斷細(xì)胞核苷酸的正常合成途徑，啟動以次黃嘌呤為底物的補救合成途徑（不受氨基蝶呤的抑制，能繼續(xù)合成出所需核苷酸）。 HAT培養(yǎng)基中有外源的胸苷，通過胸苷激酶的作用， tk+能以其為底物合成出 TTP，則 tk+細(xì)胞可繼續(xù)存活；而 tk細(xì)胞無這種合成作用，則死亡。 ? 分離不具有這種選擇記號的外源基因轉(zhuǎn)化子則采用 共轉(zhuǎn)化選擇法 。 ? 共轉(zhuǎn)化 是指兩種無關(guān)聯(lián)的 DNA混合物、能夠以磷酸鈣沉淀的方式同時轉(zhuǎn)化受體細(xì)胞。 ? 共轉(zhuǎn)化細(xì)胞的篩選仍可采用以 HAT法進行。 ② 二氫葉酸還原酶基因 ? 二氫葉酸還原酶 (DHFR)在真核細(xì)胞核苷酸生物合成過程中可催化二氫葉酸 (DHF)還原成四氫葉酸(THF)。 dhfr突變體細(xì)胞無法合成四氫葉酸，阻斷了正常核酸代謝途徑，不能在常規(guī)培養(yǎng)基上生長。但如果在常規(guī)培養(yǎng)基中加入次黃嘌呤和胸苷，則突變體細(xì)胞可以借助補救合成途徑維持生長。 ? 應(yīng)用 dhfr基因作為選擇記號的一個明顯的優(yōu)點是，由于基因擴增的結(jié)果，轉(zhuǎn)化的細(xì)胞能夠合成大量的野生型的 DHFR，檢測比較方便。 ③ 黃嘌呤 鳥嘌呤磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶(XGPRT)基因 ? XGPRT是由大腸桿菌 Ecogpt基因編碼的一種核苷酸代謝酶。哺乳動物細(xì)胞中缺少這種酶，但存在著它的類似物 次黃嘌呤 鳥嘌呤磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶(HGPRT)。 XGPRT酶能夠有效地把黃嘌呤