【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 . cDNA文庫(kù)的特點(diǎn) 提取總 RNA有商業(yè)化的試劑盒（ kit）。 2022/2/12 53 分離 mRNA用商業(yè)化的 Oligo dT纖維柱。 利用 mRNA都含有一段 polyA尾巴，將 mRNA從總 RNA（ rRNA、 tRNA等）中分離純化。 mRNA只占總 RNA的 1%2%。 （ 2） mRNA的分離純化 ① 原理 ② mRNA的分離純化 Column（柱） 2022/2/12 54 2022/2/12 55 反轉(zhuǎn)錄酶 （ 3） cDNA的合成 ① cDNA第一鏈合成 逆轉(zhuǎn)錄酶能以 RNA為模板合成 DNA。 用 Oligo dT（或隨機(jī)引物）作引物，合成cDNA的第一鏈。 mRNA cDNA 3’ 5’ 5’ AAAAAAA TTTTTTT Oligo dT引物 2022/2/12 56 用 堿 處理或用 RNaseH降解 mRNADNA雜交分子中的 mRNA。 mRNA cDNA 3’ 3’ 5’ 5’ 反轉(zhuǎn)錄酶 引物 mRNA cDNA第一鏈 3’ 3’ 5’ 5’ 引物 cDNA第一鏈 3’ 5’ 引物 ② 降解 mRNA模板 或 RNaseH 堿 2022/2/12 57 剩下的 cDNA單鏈的 3’末端一般形成一個(gè) 彎回來(lái)的雙鏈發(fā)卡結(jié)構(gòu) （機(jī)理不明），可成為合成第二條 cDNA鏈的引物。用 DNA聚合酶合成第二鏈 DNA.。 cDNA第一鏈 5’ cDNA第二鏈合成 DNA聚合酶 cDNA第一鏈 cDNA第二鏈 5’ 3’ ③ cDNA第二鏈合成 2022/2/12 58 ④ 去掉發(fā)卡結(jié)構(gòu) 核酸酶 S1 用 核酸酶 S1可以切掉發(fā)卡結(jié)構(gòu)（但這會(huì)導(dǎo)致 cDNA中有用的序列被切掉?。?。 cDNA第一鏈 cDNA第二鏈 5’ 3’ cDNA第一鏈 cDNA第二鏈 5’ 3’ 5’ 3’ 2022/2/12 59 在雙鏈 cDNA末端接上 人工接頭 ，即可與載體連接，轉(zhuǎn)入受體菌。 或借助 末端轉(zhuǎn)移酶 給載體和雙鏈 cDNA的 3’端分別加上幾個(gè) C或 G，成為粘性末端。 ： 接上人工接頭 粘性末端 CCC CCC 末端轉(zhuǎn)移酶 2022/2/12 60 2022/2/12 61 cDNA克隆的操作流程 ? 隨著 cDNA從克隆經(jīng)驗(yàn)的積累和方法的不斷改進(jìn)，逐漸形成了下列相對(duì)成熟和標(biāo)準(zhǔn)的構(gòu)建 cDNA文庫(kù)的操作流程。 ? ①轉(zhuǎn)錄酶以 oligo(dT)為引物合成 cDNA第一鏈。 ? ②用 RNase H和大腸桿菌聚合酶 Ⅰ 等合成 cDNA第二鏈。 ? ③ cDNA的甲基化 (非必需步驟 )。 ? ④ cDNA與接頭連接，并經(jīng)限制酶消化產(chǎn)生黏性末端。 ? ⑤ cDNA的分部收集 (非必需步驟 )。 ? ⑥ cDNA與末端匹配的載體連接。 ? ⑦重組 cDNA導(dǎo)人宿主菌。 2022/2/12 第一節(jié) 目的基因的制備 62 第一節(jié) 目的基因的制備 ? 直接法制備基因 ? 從基因組文庫(kù)中釣取目的基因 ? 從 cDNA文庫(kù)中釣取目的基因 ? 通過(guò) PCR直接擴(kuò)增出目的基因 2022/2/12 第一節(jié) 目的基因的制備 63 4 通過(guò) PCR直接擴(kuò)增出目的基因 ? 前提 :目的基因的全序列或其兩側(cè)序列 為已知， 合成一對(duì)與模板 DNA互補(bǔ)的引物 ， 擴(kuò)增出 DNA片段。 ? 模板 ： 基因組 DNA， mRNA序列 ， 或是已克隆到某一載體上的基因片段。為了克隆操作的方便或保證克隆后 續(xù)工作需要， 常常要在設(shè)計(jì)引物時(shí)對(duì)其 兩 端作一些修飾 ，如 帶限制性內(nèi)切酶切點(diǎn) ,某種啟動(dòng)子序列或起始或終止密碼 等 ,便于下一步的重組克隆和基因的表達(dá)和調(diào)控研究。 2022/2/12 64 通過(guò) PCR直接擴(kuò)增出目的基因策略 2022/2/12 第一節(jié) 目的基因的制備 65 ? 優(yōu)缺點(diǎn)： 與傳統(tǒng)的 DNA克隆方法比較 ， 省時(shí)、省力 , 但要求待擴(kuò)增的 DNA片段的序列必需是已知的 ， 至少要求兩端長(zhǎng)約 20bp的序列是已知的。另外 ， 合成的 DNA片段長(zhǎng)度有限 ， 一般在 2kb以內(nèi) ，超過(guò) 2kb時(shí)擴(kuò)增效果顯著下降 。 ? 如要大量擴(kuò)增未知序列的特異 DNA片段 ， 或是更長(zhǎng)的 DNA片段 ， 則須選擇特殊類型的 PCR策略。通常 PCR反應(yīng)有如下幾種類型 : 2022/2/12 66 套式 PCR（ nested PCR） ? 也叫巢式 PCR， 是指用兩對(duì)引物擴(kuò)增同一樣品的方法。即 在兩對(duì)引物中 ， 一對(duì)引物與靶序列的復(fù)性結(jié)合位點(diǎn) 處于 另一對(duì)引物擴(kuò)增的 DNA序列內(nèi) ， 前者稱為內(nèi)部引物 ，后者稱為外側(cè)引物。一般先用外側(cè)引物擴(kuò)增一段較長(zhǎng)的靶序列 ， 然后 以 第一次擴(kuò)增的產(chǎn)物 為模板， 再用內(nèi)部引物擴(kuò)增其中的部分片段。 ? 套式 PCR較常規(guī) PCR靈敏度大大提高 ， 同時(shí)也有較強(qiáng)的的特異性 ， 假 陽(yáng) 性極少。 2022/2/12 第一節(jié) 目的基因的制備 67 反向 PCR(inverse PCR) ? 當(dāng)一個(gè)未知序列位于已知序列的上游 ， 一般可用已知靶序列的一個(gè)引物 ( 即與 3‘端互補(bǔ)的引物 )進(jìn)行單向 PCR線性擴(kuò)增 , 而反向 PCR技術(shù)則可利用二個(gè)靶序列引物對(duì)未知片段進(jìn)行常規(guī) PCR擴(kuò)增。反向 PCR包括下列三個(gè)步驟 2022/2/12 第一節(jié) 目的基因的制備 68 首先 ， 用限制性核酸內(nèi)切酶消化待測(cè)線性 DNA模板。 其次 ， 使酶切后的線性 DNA 模板連接成為環(huán)狀分子 ， 或加上銜接頭后再連接成環(huán)狀。 第三 ， 用另一種限制酶消化 ，將環(huán)狀 DNA從已知區(qū)域中間切開 ， 則線性化 DNA的兩側(cè)為已知序列 ， 未知區(qū)域夾在中間 ，用與已知區(qū)域可使未知序列大量擴(kuò)增出來(lái)。 2022/2/12 第一節(jié) 目的基因的制備 69 錨定 PCR(anchored PCR) ? 錨定 PCR， 又稱為單側(cè) PCR， 是指通過(guò)添加錨定引物接頭的方式來(lái)擴(kuò)增合成未知序列或未全知序列的方法。 ? 常見的錨定 PCR類型是利用未知序列中一小段已知序列的信息來(lái)擴(kuò)增合成已知序列上游或下游片段 ， 最后獲得全部序列。 2022/2/12 第一節(jié) 目的基因的制備 70 其基本步驟 ? 與此 po1y(dG)相對(duì)應(yīng)的 poly(dC)即為錨定引物 。 ? 為保證擴(kuò)增特異性 ， 錨定引物通常在 12堿基以上。在錨定引物和與基因特異配對(duì)的引物參與下 ， 可以擴(kuò)增帶有同源多聚物尾巴的 cDNA序列。與基因特異配對(duì)的引物通常是在未知序列中一小段已知序列的基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)合成的 ，而該已知序列一般是由純化蛋白的部分氨基酸序列推測(cè)出來(lái)或從其他材料中獲得的部分 mRNA序列。 分離細(xì)胞總 RNA或 mRNA 合成 cDNA 逆轉(zhuǎn)錄酶 在 cDNA3‘末端 加上 poly(dG)尾 DNA末端轉(zhuǎn)移酶 2022/2/12 第一節(jié) 目的基因的制備 71 反轉(zhuǎn)錄 PCR（ RTPCR） ? RTPCR， 是將 mRNA反轉(zhuǎn)錄與 PCR技術(shù)相偶聯(lián)的一種基因分離技術(shù)。通過(guò) mRNA反轉(zhuǎn)錄 ， 得到對(duì)應(yīng)的 cDNA， 然后利用特定的 PCR引物直接以反轉(zhuǎn)錄得到的 cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng) ， 獲得大量所需的基因。 ? 反轉(zhuǎn)錄可用 總 RNA或總 poly(A)RNA為模板進(jìn)行 ， 反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物也無(wú)須轉(zhuǎn)變成雙鏈 cDNA,即可進(jìn)行 PCR擴(kuò)增。 2022/2/12 第一節(jié) 目的基因的制備 72 第一 連續(xù) RTPCR( 兩階段單管式 ) ? 由 mRNA反轉(zhuǎn)錄成 cDNA和 DNA的 PCR擴(kuò)增是兩個(gè)完全不同的酶催化反應(yīng)過(guò)程 ， 連續(xù) RTPCR將這兩種不同的酶催化過(guò)程放在一個(gè)管中連續(xù)反應(yīng) ， 但在空間上兩種反應(yīng)仍是分開進(jìn)行。在該程序中利用一種特制蠟燭冷卻形成的蠟層 ，將兩種反應(yīng)混合物分開成上下兩層 ， 反應(yīng)首先在較低的溫度下進(jìn) 行反轉(zhuǎn)錄 ， 由 mRNA合成 cDNA； 當(dāng)反應(yīng)結(jié)束 , 溫度升高到 95℃ ， 使蠟層熔化 ， 上下層反應(yīng)液混合在一起 ， 下層混合物中的 TaqDNA聚合酶利用上層合成的 cDNA作為模板進(jìn)行 PCR擴(kuò)增。 2022/2/12 第一節(jié) 目的基因的制備 73 第二 長(zhǎng)距離 RTPCR( 兩階段雙管式 ) ? 長(zhǎng)距離 RTPCR與連續(xù) RTPCR都是使兩種酶促反應(yīng)分開進(jìn)行 ， 但長(zhǎng)距離 RTPCR能擴(kuò)增全長(zhǎng) cDNA， 得到更長(zhǎng)的 DNA 產(chǎn)物。 ? 在反轉(zhuǎn)錄階段 ， 首先使模板 —— 引物融合 ， 然后再加入反應(yīng)混合物并預(yù)熱 ， 最后加逆轉(zhuǎn)錄酶 ， 這樣便分別滿足各個(gè)步驟的最適條件。進(jìn)行 PCR循環(huán)時(shí) ， 首先進(jìn)行 95℃熱起始 ， 再加入 Taq DNA聚合酶 ， 采用雙 shuttle PCR 程序延長(zhǎng)合成時(shí)間 ， 由此擴(kuò)增出長(zhǎng)達(dá) 4～ 6 kb的 DNA片段。 2022/2/12 第一節(jié) 目的基因的制備 74 鍋柄 PCR（ panhandle PCR） ? 用 PCR擴(kuò)增未知序列 ， 因?yàn)椴荒茉O(shè)計(jì)所需要的引物而難以實(shí)現(xiàn)。鍋柄 PCR就是為擴(kuò)增未知序列而設(shè)計(jì)的一種策略 。 ? 如果一段未知序列處于已知序列的上游 ， 那么可根據(jù)已知的 3‘端序列設(shè)計(jì)引物而擴(kuò)增出未知序列 ， 如果未知序列位于已知序列下游則須將 5’端的已知序列拷貝到未知序列的下游 ， 這樣使未知序列的兩側(cè)都含有已知序列 ，據(jù)此可以擴(kuò)增未知片段 ， 也能從 3‘， 5’兩端測(cè)定已知基因的序列。 2022/2/12 第一節(jié) 目的基因的制備 75 鍋柄 PCR實(shí)施步驟 ? ①用內(nèi)切酶消化環(huán)狀 dsDNA產(chǎn)生 5‘黏 末端線型 DNA片段 ， 用 Klenow酶填平 5’黏 末端 ， 然后用 BAP脫去 539。磷酸 ， 避免自我環(huán)化。 ? ②合成一個(gè)與 5‘末端堿基和已知基因的 5’端內(nèi)部某個(gè)區(qū)域能互補(bǔ)的附加引物 ， 與上述線性化片段的 3’端連接 ， 539。端由于脫磷而不能連接。 2022/2/12 第一節(jié) 目的基因的制備 76 ? ③將連接物變性后再冷卻復(fù)性 ， 其中一條單鏈DNA分子 (負(fù)鏈 )由于附 加引物而與互補(bǔ)區(qū)域以堿基配對(duì)形成鍋柄狀的鏈內(nèi)二級(jí)結(jié)構(gòu) ， 而正鏈的附加引物是不能互補(bǔ)的。 ? ④鍋柄結(jié)構(gòu)中出現(xiàn)一個(gè)龜縮的 3‘端 ， 它可作為引物進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增 ， 經(jīng)變性成單鏈后而使未知區(qū)域的 3’， 539。兩側(cè)都帶有完整的已知基因序列。 2022/2/12 77 ? ⑤以 3‘ 端的引物進(jìn)行單向 PCR擴(kuò)增 ， 合成另一條鏈 ， 不過(guò)如果全部序列太長(zhǎng) ， 則難以達(dá)到 5’端的已知區(qū)域 ， 得不到全長(zhǎng)片段。 ? ⑥變性后再次冷卻生成鏈內(nèi)二級(jí)結(jié)構(gòu) ， 得到另一條鏈的模板 ， 龜縮的 3‘端同樣可作引物進(jìn)行 PCR擴(kuò)增而得到全長(zhǎng)片段 ， 其中未知基因處于中間 ， 3‘、 539。 兩側(cè)是已知基因的全序列。 ? ⑦套式 PCR: 用引物對(duì) (l)和 (2)或 (3)分別作外側(cè)引物和內(nèi)部引物可以擴(kuò) 增不同長(zhǎng)度的 DNA片段，其中包括完整的已知序列。