【正文】 的基因的功能克隆篩選 ? 2 序列克隆法篩選 ? 3 差別雜交及減法雜交技術(shù)篩選 ? 4 差示分析法篩選 ? 5 功能結(jié)合法篩選 ? 6 其他篩選方法 2022/2/12 第二節(jié) 目的基因的分離 82 1 目的基因的功能克隆篩選法 ? 根據(jù)特異蛋白分離目的基因 ? 在基因工程發(fā)展的早期階段 ， 有關(guān)功能基因的分離與克隆多是在特異蛋白分離、純化和測(cè)序的基礎(chǔ)上完成的。 2022/2/12 78 第五章 目的基因的制備 第一節(jié) 目的基因的制備 第二節(jié) 目的基因的分離 2022/2/12 79 第二節(jié) 目的基因的分離 ? 1 目的基因的功能克隆 ? 2 序列克隆法 ? 3 差別雜交及減法雜交技術(shù) ? 4 差示分析法 ? 5 功能結(jié)合法 ? 6 其他方法 2022/2/12 第二節(jié) 目的基因的分離 80 第二節(jié) 目的基因的分離 ? 在基因文庫中 ,不論是 cDNA文 庫還是基因組 DNA文庫 ,含 目的基因的克隆子都只是數(shù)以萬計(jì)的克隆子中的一個(gè) ,究竟哪一個(gè)克隆子含有我們所要研究的目的基因 ？ 因此克隆一個(gè)基因的下一個(gè)步驟就是從基因文庫中篩選分離出含有目的基因的特定克隆子 。 兩側(cè)是已知基因的全序列。 2022/2/12 77 ? ⑤以 3‘ 端的引物進(jìn)行單向 PCR擴(kuò)增 ， 合成另一條鏈 ， 不過如果全部序列太長 ， 則難以達(dá)到 5’端的已知區(qū)域 ， 得不到全長片段。 ? ④鍋柄結(jié)構(gòu)中出現(xiàn)一個(gè)龜縮的 3‘端 ， 它可作為引物進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增 ， 經(jīng)變性成單鏈后而使未知區(qū)域的 3’， 539。端由于脫磷而不能連接。磷酸 ， 避免自我環(huán)化。 ? 如果一段未知序列處于已知序列的上游 ， 那么可根據(jù)已知的 3‘端序列設(shè)計(jì)引物而擴(kuò)增出未知序列 ， 如果未知序列位于已知序列下游則須將 5’端的已知序列拷貝到未知序列的下游 ， 這樣使未知序列的兩側(cè)都含有已知序列 ，據(jù)此可以擴(kuò)增未知片段 ， 也能從 3‘， 5’兩端測(cè)定已知基因的序列。 2022/2/12 第一節(jié) 目的基因的制備 74 鍋柄 PCR（ panhandle PCR） ? 用 PCR擴(kuò)增未知序列 ， 因?yàn)椴荒茉O(shè)計(jì)所需要的引物而難以實(shí)現(xiàn)。 ? 在反轉(zhuǎn)錄階段 ， 首先使模板 —— 引物融合 ， 然后再加入反應(yīng)混合物并預(yù)熱 ， 最后加逆轉(zhuǎn)錄酶 ， 這樣便分別滿足各個(gè)步驟的最適條件。在該程序中利用一種特制蠟燭冷卻形成的蠟層 ，將兩種反應(yīng)混合物分開成上下兩層 ， 反應(yīng)首先在較低的溫度下進(jìn) 行反轉(zhuǎn)錄 ， 由 mRNA合成 cDNA； 當(dāng)反應(yīng)結(jié)束 , 溫度升高到 95℃ ， 使蠟層熔化 ， 上下層反應(yīng)液混合在一起 ， 下層混合物中的 TaqDNA聚合酶利用上層合成的 cDNA作為模板進(jìn)行 PCR擴(kuò)增。 ? 反轉(zhuǎn)錄可用 總 RNA或總 poly(A)RNA為模板進(jìn)行 ， 反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物也無須轉(zhuǎn)變成雙鏈 cDNA,即可進(jìn)行 PCR擴(kuò)增。 分離細(xì)胞總 RNA或 mRNA 合成 cDNA 逆轉(zhuǎn)錄酶 在 cDNA3‘末端 加上 poly(dG)尾 DNA末端轉(zhuǎn)移酶 2022/2/12 第一節(jié) 目的基因的制備 71 反轉(zhuǎn)錄 PCR（ RTPCR） ? RTPCR， 是將 mRNA反轉(zhuǎn)錄與 PCR技術(shù)相偶聯(lián)的一種基因分離技術(shù)。在錨定引物和與基因特異配對(duì)的引物參與下 ， 可以擴(kuò)增帶有同源多聚物尾巴的 cDNA序列。 2022/2/12 第一節(jié) 目的基因的制備 70 其基本步驟 ? 與此 po1y(dG)相對(duì)應(yīng)的 poly(dC)即為錨定引物 。 2022/2/12 第一節(jié) 目的基因的制備 69 錨定 PCR(anchored PCR) ? 錨定 PCR， 又稱為單側(cè) PCR， 是指通過添加錨定引物接頭的方式來擴(kuò)增合成未知序列或未全知序列的方法。 其次 ， 使酶切后的線性 DNA 模板連接成為環(huán)狀分子 ， 或加上銜接頭后再連接成環(huán)狀。 2022/2/12 第一節(jié) 目的基因的制備 67 反向 PCR(inverse PCR) ? 當(dāng)一個(gè)未知序列位于已知序列的上游 ， 一般可用已知靶序列的一個(gè)引物 ( 即與 3‘端互補(bǔ)的引物 )進(jìn)行單向 PCR線性擴(kuò)增 , 而反向 PCR技術(shù)則可利用二個(gè)靶序列引物對(duì)未知片段進(jìn)行常規(guī) PCR擴(kuò)增。一般先用外側(cè)引物擴(kuò)增一段較長的靶序列 ， 然后 以 第一次擴(kuò)增的產(chǎn)物 為模板， 再用內(nèi)部引物擴(kuò)增其中的部分片段。通常 PCR反應(yīng)有如下幾種類型 : 2022/2/12 66 套式 PCR（ nested PCR） ? 也叫巢式 PCR， 是指用兩對(duì)引物擴(kuò)增同一樣品的方法。另外 ， 合成的 DNA片段長度有限 ， 一般在 2kb以內(nèi) ，超過 2kb時(shí)擴(kuò)增效果顯著下降 。為了克隆操作的方便或保證克隆后 續(xù)工作需要， 常常要在設(shè)計(jì)引物時(shí)對(duì)其 兩 端作一些修飾 ，如 帶限制性內(nèi)切酶切點(diǎn) ,某種啟動(dòng)子序列或起始或終止密碼 等 ,便于下一步的重組克隆和基因的表達(dá)和調(diào)控研究。 2022/2/12 第一節(jié) 目的基因的制備 62 第一節(jié) 目的基因的制備 ? 直接法制備基因 ? 從基因組文庫中釣取目的基因 ? 從 cDNA文庫中釣取目的基因 ? 通過 PCR直接擴(kuò)增出目的基因 2022/2/12 第一節(jié) 目的基因的制備 63 4 通過 PCR直接擴(kuò)增出目的基因 ? 前提 :目的基因的全序列或其兩側(cè)序列 為已知， 合成一對(duì)與模板 DNA互補(bǔ)的引物 ， 擴(kuò)增出 DNA片段。 ? ⑥ cDNA與末端匹配的載體連接。 ? ④ cDNA與接頭連接，并經(jīng)限制酶消化產(chǎn)生黏性末端。 ? ②用 RNase H和大腸桿菌聚合酶 Ⅰ 等合成 cDNA第二鏈。 ： 接上人工接頭 粘性末端 CCC CCC 末端轉(zhuǎn)移酶 2022/2/12 60 2022/2/12 61 cDNA克隆的操作流程 ? 隨著 cDNA從克隆經(jīng)驗(yàn)的積累和方法的不斷改進(jìn)，逐漸形成了下列相對(duì)成熟和標(biāo)準(zhǔn)的構(gòu)建 cDNA文庫的操作流程。 cDNA第一鏈 cDNA第二鏈 5’ 3’ cDNA第一鏈 cDNA第二鏈 5’ 3’ 5’ 3’ 2022/2/12 59 在雙鏈 cDNA末端接上 人工接頭 ，即可與載體連接，轉(zhuǎn)入受體菌。用 DNA聚合酶合成第二鏈 DNA.。 mRNA cDNA 3’ 5’ 5’ AAAAAAA TTTTTTT Oligo dT引物 2022/2/12 56 用 堿 處理或用 RNaseH降解 mRNADNA雜交分子中的 mRNA。 （ 2） mRNA的分離純化 ① 原理 ② mRNA的分離純化 Column（柱） 2022/2/12 54 2022/2/12 55 反轉(zhuǎn)錄酶 （ 3） cDNA的合成 ① cDNA第一鏈合成 逆轉(zhuǎn)錄酶能以 RNA為模板合成 DNA。 利用 mRNA都含有一段 polyA尾巴，將 mRNA從總 RNA（ rRNA、 tRNA等）中分離純化。 . 構(gòu)建 cDNA文庫的一般步驟 （ 1）總 RNA（ total RNA）提取 . cDNA文庫的特點(diǎn) 提取總 RNA有商業(yè)化的試劑盒（ kit）。 （ 3）包含了所有 編碼蛋白質(zhì)的基因 。 cDNA文庫的構(gòu)建 2022/2/12 52 （ 1） 不含內(nèi)含子序列 。 2022/2/12 第一節(jié) 目的基因的制備 49 第一節(jié) 目的基因的制備 ? 直接法制備基因 ? 從基因組文庫中釣取目的基因 ? 從 cDNA文庫中釣取目的基因 ? 通過 PCR直接擴(kuò)增出目的基因 2022/2/12 第一節(jié) 目的基因的制備 50 3 從 cDNA文庫中釣取目的基因 ? cDNA文庫的構(gòu)建 ? cDNA克隆的操作流程 2022/2/12 51 . cDNA 以 mRNA為模板 逆轉(zhuǎn)錄 出的 DNA稱 cDNA。 注意，在以細(xì)胞為基礎(chǔ)的克隆策略中，DNA最初是由非特異性的方法并克隆的，因此在結(jié)尾步驟需要篩選出目標(biāo)克隆。該方法的基本策略是采用“反應(yīng)池” ，將基因文庫分裝 96孔培養(yǎng)板，如有 2304個(gè)克隆分別置于 24個(gè) 96孔培養(yǎng)板中，現(xiàn)以反應(yīng)板為單位，將 96個(gè)克隆混合成一個(gè)“反應(yīng)池”，進(jìn)行一個(gè) PCR反應(yīng)，如圖： 2022/2/12 46 ? 從 24個(gè)反應(yīng)板中找出具 有陽性克隆 的反應(yīng)板，再將該板中的 12個(gè)橫向克隆與 8個(gè)縱向克隆分別混合，形成 12個(gè)橫向池及 8個(gè)縱向池，進(jìn)行 20個(gè)（ 8+12）反應(yīng)，如圖，橫向陽性池與縱向陽性池交叉的孔為陽性單克隆，通過44個(gè)反應(yīng)可從 2304個(gè)克隆中篩選分離出單個(gè)克隆。只適用于表達(dá)文庫的篩選，并只能篩選出表達(dá)了的克隆。 2022/2/12 44 （ 1）核酸雜交方法 ? 適用于大量篩選，常用，可靠。分離目的基因也要知道與目的基因有關(guān)的某些或某個(gè)特征，才能據(jù)此找到相關(guān)基因。 2022/2/12 38 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 A B C D E F G 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 D A B C E F G 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 2022/2/12 39 01 04 12 06 13 14 02 17 07 19 11 15 05 08 16 03 10 09 20 18 D A B C E F G 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 F C A D G E B 2022/2/12 40 （ 3）染色體走讀法（ chromosome walking） ? 從基因文庫中任取一個(gè)克隆作為染色體走讀的起點(diǎn)，將之兩端序列分別亞克隆，亞克隆片段在 ~ kb范圍內(nèi) ? 分別以上述亞克隆 DNA片段為探針，雜交同一基因文庫，雜交陽性克隆中的插入 DNA片段必定與起點(diǎn)克隆所含的 DNA片段連鎖在一起 ? 然后再以陽性克隆片段的兩端序列為探針，進(jìn)行第二步走讀，直至線型染色體 DNA的端點(diǎn) 2022/2/12 41 染色體走讀法（ chromosome walking） 走讀的起點(diǎn)克隆片段 亞克隆旁測(cè)序列 探針標(biāo)記 第一輪雜交 陽性克隆 陽性克隆 第二輪雜交 第二輪雜交 2022/2/12 42 染色體走讀法（ chromosome walking） 走讀的起點(diǎn)克隆片段 2022/2/12 43 從基因組文庫中釣取目的基因 ? 構(gòu)建了基因