基因的重組ppt課件(編輯修改稿)
2025-05-25 22:39 本頁面
【文章內(nèi)容簡介】 GAATTC T 重組 但移碼突變！ 4. 防止載體自身環(huán)化連接 （ 1）提高插入片斷的用量 連接反應(yīng)體系中，插入片斷比載體多 10倍以上。 （ 2）用堿性磷酸酶處理載體 載體切口的 5’ 磷酸被除去，不能自我連接。但可以與插入片斷以單鏈連接。 5’ 3’ 載體 插入片斷 1. 載體自身環(huán)化連接 2. 載體之間互相連接 3. 插入片段互相連接 4. 一個載體與幾個插入片段重組 五、載體和外源 DNA插入片段的連接結(jié)果 5. 幾個載體與一個插入片段重組 （能存活） （能存活） （不能存活） （能存活） （能存活） 17 黏性末端連接法是最常用的連接方法，具有許多優(yōu)點，但是也有一些不足，請指出這些不足之處。 黏性末端連接法不足之處有： (1)載體易自身環(huán)化； (2)若是用同一種限制性內(nèi)切核酸酶產(chǎn)生的黏性末端連接又不易定向克??； (3)難插入特定的基因； (4)再者就是大片段 DNA的重組率較低，即使用堿性磷酸酶處理了載體，防止了載體的自身環(huán)化，載體也有成環(huán)的傾向； (5)用這種方法產(chǎn)生的重組體往往含有不止一個外源片段或不止一個載體連接起來的串聯(lián)重組體，增加篩選工作的困難。 1. 目的 增加受體菌細(xì)胞膜的通透性。 第二節(jié) 重組體導(dǎo)入細(xì)菌細(xì)胞 一、感受態(tài)大腸桿菌的制備 感受態(tài)：處于能吸收周圍環(huán)境中 DNA分子的生理狀態(tài)的細(xì)胞 用 CaCl2處理大腸桿菌，能增加膜的通透性。 3. 制備原理 該法是 197年 Mande和 lHiga發(fā)現(xiàn)的，并且 1972 Cohen 做實驗進(jìn)一步驗證。 其轉(zhuǎn)化效率為每微克質(zhì)粒 DNA可以獲得 5 1062 107的轉(zhuǎn)化菌落。 轉(zhuǎn)化的可能原因為： 在 0℃ 的 CaCl2低滲溶液中， 細(xì)菌細(xì)胞發(fā)生膨脹，同時 Ca2+使細(xì)胞膜磷脂層形成液晶結(jié)構(gòu)，促使細(xì)胞外膜與內(nèi)膜間隙中的部分核酸酶解離開來， 誘導(dǎo)大腸桿菌形成感受態(tài)。 Ca2+能與加入的 DNA分子結(jié)合 ，形成抗脫氧核糖核酸酶的羥基 —— 磷酸鈣復(fù)合物，并粘附在細(xì)胞膜的外表面上，當(dāng) 42 ℃ 熱擊短暫處理細(xì)菌細(xì)胞時，細(xì)胞膜的液晶結(jié)構(gòu)發(fā)生劇烈擾動，并隨之出現(xiàn)許多間隙 ，為 DNA分子提供進(jìn)入細(xì)胞的通道。 4. 制備過程 培養(yǎng)大腸桿菌 OD600至 On ice 510 min 4℃ 離心收集菌 用冰冷的60mMCaCl2重懸 4℃ 離心收集菌 4℃ 離心收集菌 分裝、 70 ℃凍存 用冰冷的60mMCaCl2重懸 On ice 30 min 用冰冷的60mMCaCl2重懸 二、重組 DNA導(dǎo)入大腸桿菌 （ 1）轉(zhuǎn)化（ transformation) 大腸桿菌捕獲 質(zhì)粒 DNA的過程。 （ 2）轉(zhuǎn)染（ transfection) 大腸桿菌捕獲裸露的 噬菌體 DNA的過程。 1. 外源 DNA導(dǎo)入細(xì)菌的幾種方法 （ 3）轉(zhuǎn)導(dǎo)（ transduction) 借助 噬菌體 把外源 DNA導(dǎo)入細(xì)菌的過程。 每 ?gDNA轉(zhuǎn)化成功的細(xì)菌克隆數(shù)。 3. 轉(zhuǎn)化方法 2. 轉(zhuǎn)化率 簡單 ，但轉(zhuǎn)化效率不高（ 106108/?gDNA）。 （ 1）熱休克法（ heat shock） 轉(zhuǎn)化效率高（高于 109/?gDNA）。 （ 2）電轉(zhuǎn)化法 DNA分子轉(zhuǎn)化受體菌獲得轉(zhuǎn)化子的效率 10ng載體 DNA 100?L感受態(tài)菌 On ice混合，靜置10分鐘 42186。C 1分鐘 加入 1mL LB培養(yǎng)基 37℃ 搖 1小時 10100?L轉(zhuǎn)化液涂含抗菌素的平板 吸附 DNA 攝入 DNA （ 1）熱休克法 LB培養(yǎng)受體菌至OD600= 冰浴 15分鐘，2176。 C離心集菌 冰冷的水重懸菌體 2176。 C離心集菌 冰冷的水重懸菌體 2176。 C離心收集菌體 少量冰冷的水重懸 分裝成 50300?L 電轉(zhuǎn)儀調(diào)為,25?F 脈沖控制器200400? ?g質(zhì)粒DNA On ice混合 加入
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