目的基因的克隆ppt課件(編輯修改稿)
2025-05-28 22:17 本頁(yè)面
【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 碎片，聚丙烯酰胺凝膠電泳，每 10個(gè) YAC克隆走在同一塊板上，形成 10個(gè)克隆的特征性 DNA指紋圖譜 電腦分析指紋圖譜，如發(fā)現(xiàn)任何兩個(gè)克隆 DNA的指紋圖譜有部分相同的，則其兩個(gè) YAC片段就有互相重疊的可能性，于是這兩個(gè) YAC克隆的 DNA片段克隆在染色體上是排列一起的 酶切片段末端標(biāo)記法 酶切片段末端標(biāo)記法 H H H H S S S S S S S S S S S S S S S S S S S 單一克隆指紋圖譜 十克隆指紋圖譜 載體 DNA 克隆 DNA 基因組文庫(kù)重組克隆的排序 將若干 YAC克隆固定在薄膜上，并復(fù)制二十份薄膜；合成20種不同序列的短探針，其序列是隨機(jī)的 用 20種探針隨機(jī)定位雜交（一對(duì)一） 20份 YAC克隆薄膜 如果某兩個(gè)克隆同時(shí)對(duì)同一種探針呈現(xiàn)雜交陽(yáng)性反應(yīng)，則這兩個(gè)克隆有可能是相互重疊的。若將雜交陽(yáng)性結(jié)果記為 ? 1?，而陰性結(jié)果記為 ? 0? ，可清晰地列成一張表，最終排出上述YAC克隆的排列順序 隨機(jī)探針聯(lián)合雜交法 C cDNA法 cDNA法克隆目的基因的基本戰(zhàn)略 cDNA法分離目的基因的基本程序 cDNA法法克隆目的基因的局限性 cDNA法克隆目的基因的基本戰(zhàn)略 mRNA cDNA第一鏈的合成 5‘ ppp’5 G G AAAAAAAAAAAAAAOH 3’ 5‘ ppp’5 G G AAAAAAAAAAAAAAOH 3’ TTTTTTTTTTTTTTp 5’ 5‘ ppp’5 G G AAAAAAAAAAAAAAOH 3’ TTTTTTTTTTTTTTp 5’ cDNA第一鏈 引物 退火 逆轉(zhuǎn)錄酶 dNTPs cDNA第二鏈的合成 煮沸 NaOH 自身引導(dǎo)法： 獲得的雙鏈 cDNA 5’端會(huì)有幾對(duì)堿基缺失 AAAAAAAAAAAAAA 5‘ ppp’5 G G AAAAAAAAAAAAAAOH 3’ TTTTTTTTTTTTTTp 5’ TTTTTTTTTTTTTTp 5’ TTTTTTTTTTTTTTp 5’ AAAAAAAAAAAAAAOH 3’ TTTTTTTTTTTTTT OH 3’ Klenow dNTPs S1 cDNA第二鏈的合成 DNApol dNTPs RNaesH 置換合成法： 獲得的雙鏈 cDNA 5’端也會(huì)有幾對(duì)堿基缺失 5‘ ppp’5 G G AAAAAAAAAAAAAAOH 3’ TTTTTTTTTTTTTTp 5’ AAAAAAAAAAAAAAp 5’ 5’ S1 AAAAAAAOH 3’ TTTTTTTTTTTTTTp 5’ 5’ TTTTTTTTTTTTTTOH 3’ AAAAAAAAAAAAAA 5’ 5’ TTTTTTTTTTTTTT 3’ 3’ T4DNA ligase cDNA第二鏈的合成 dCTP TdT 引導(dǎo)合成法： 獲得的雙鏈 cDNA 能保留完整的 5’端序列 5‘ ppp’5 G G AAAAAOH 3’ TTTTTp 5’ 3‘ HO 5‘ ppp’5 G G AAAAACCCCCCCOH 3’ 3‘ HOCCCCCCC TTTTTp 5’ 3‘ HOCCCCCCC TTTTTp 5’ 3‘ HOCCCCCCC TTTTTp 5’ 5‘ pGGGGGGG 3‘ HOCCCCCCC TTTTTp 5’ 5‘ pGGGGGGG AAAAAOH 3’ NaOH 退火 Klenow dNTPs Terminal deoxynucleotidyl transferaser cDNA法克隆目的基因的基本戰(zhàn)略 雙鏈 cDNA的克隆 雙鏈平頭的 cDNA通?？梢允褂孟铝腥N方法克隆入載體中： 平頭末端直接與載體連接， 但插入的片段無(wú)法回收 平頭兩端分別接同聚物尾， 最好是 AT同聚物尾，這樣重組 分子可通過(guò)加熱局部變性和 S1核酸酶處理回收插入片段 加裝人工接頭引入酶切口， 以便插入片段回收 cDNA法分離目的基因的基本程序 完備分離程序 提取細(xì)胞總 mRNA， 合成總 cDNA， 將之全部克隆 ， 然后借助于合適的篩選手段找到 目的重
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