【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 段的長(zhǎng)度，濃度過(guò)高易產(chǎn)生錯(cuò)誤堿基的摻入 ,濃度過(guò)低則降低反應(yīng)產(chǎn)量；理論上 4種 dNTP各 20μmol/L, 就足以在 100μL反應(yīng)中合成 DNA。當(dāng) dNTP終濃度大于 50 mmol/L時(shí)可抑制 Taq DNA聚合酶的活性； ②四種 dNTP濃度應(yīng)相等 ，以減少合成中由于某種 dNTP不足而導(dǎo)致的摻入錯(cuò)誤； ③ dNTP可與 Mg2+結(jié)合 ,使游離的 Mg2+濃度下降 ,影響 DNA聚合酶的活性。 ④ dNTP制備 ：應(yīng)用 NaOH將 dNTP溶液的 pH調(diào)至 ，并用分光光度計(jì)測(cè)定其準(zhǔn)確濃度。 dNTP原液可配成 510mmol/L并分裝，20℃貯存。 2022/5/26 25 PCR法獲取目的基因 2022/5/26 PCR法獲取目的基因 26 （ 2） 循環(huán)參數(shù) ①預(yù)變性： 94 ℃ 5 min ②變性： 94 ℃ 20 s45 s（使雙鏈 DNA解鏈為單鏈） ③退火： 溫度由引物的解鏈溫度 Tm決定，時(shí)間為 45 s左右。 提高溫度能減少引物與模板的非特異性結(jié)合；降低溫度 可增加反應(yīng)的靈敏性。 ④延伸： 一般為 72℃，時(shí)間由擴(kuò)增片段長(zhǎng)度決定。 ⑤循環(huán)次數(shù)： 主要取決于模板 DNA的濃度，一般為 2535次 。次數(shù)過(guò)多，導(dǎo)致擴(kuò)增效率降低，錯(cuò)誤摻入 率增加。到達(dá)平臺(tái)期 (Plateau)所需循環(huán)次數(shù)取 決于樣品中模板的拷貝數(shù)。 ⑥延伸補(bǔ)齊： 72 ℃， 5 min— 10 min 2022/5/26 27 PCR法獲取目的基因 2022/5/26 PCR法獲取目的基因 28 2022/5/26 PCR法獲取目的基因 29 ? PCR應(yīng)該在一個(gè)沒(méi)有脫氧核糖核酸污染的干凈環(huán)境中進(jìn)行，最好設(shè)立一個(gè)專(zhuān)用的 PCR實(shí)驗(yàn)空間。 ? 純化模板所選用的方法對(duì)污染的風(fēng)險(xiǎn)有極大影響。一般而言，只要能夠得到可靠的結(jié)果，純化的方法越簡(jiǎn)單越好。 ? 所有試劑都應(yīng)該沒(méi)有核酸和核酸酶的污染。操作過(guò)程中均應(yīng)戴手套。 ? PCR試劑配制應(yīng)使用最高質(zhì)量的新鮮雙蒸水，采用 濾膜過(guò)濾除菌或高壓滅菌。 ? 試劑都應(yīng)該以大體積配制，試驗(yàn)一下是否滿(mǎn)意，然后分裝成僅夠一次使用的量?jī)?chǔ)存，從而確保實(shí)驗(yàn)與實(shí)驗(yàn)之間的連續(xù)性。 ? 試劑或樣品準(zhǔn)備過(guò)程中都要使用一次性滅菌的塑料瓶和管子，玻璃器皿應(yīng)洗滌干凈并高壓滅菌。 ? PCR的樣品應(yīng)在冰浴上融解，并且要充分混勻。 2022/5/26 PCR法獲取目的基因 30 ? 陽(yáng)性對(duì)照 :在建立 PCR反應(yīng)實(shí)驗(yàn)室及一般的檢驗(yàn)單位都應(yīng)設(shè)有 PCR陽(yáng)性對(duì)照，它是 PCR反應(yīng)是否成功、產(chǎn)物條帶位置及大小是否合乎理論要求的一個(gè)重要的參考標(biāo)志。 ? 陽(yáng)性對(duì)照要選擇擴(kuò)增度中等、重復(fù)性好，經(jīng)各種鑒定是該產(chǎn)物的標(biāo)本，如以重組質(zhì)粒為陽(yáng)性對(duì)照，其含量宜低不宜高 (100個(gè)拷貝以下 )。 但陽(yáng)性對(duì)照尤其是重組質(zhì)粒及高濃度陽(yáng)性標(biāo)本，對(duì)檢測(cè)或擴(kuò)增樣品污染的可能性很大。因而當(dāng)某一 PCR試劑經(jīng)自己使用穩(wěn)定，檢驗(yàn)人員心中有數(shù)時(shí)，在以后的實(shí)驗(yàn)中可免設(shè)陽(yáng)性對(duì)照。 2022/5/26 PCR法獲取目的基因 31 ? 陰性對(duì)照 :每次 PCR實(shí)驗(yàn)務(wù)必做陰性對(duì)照。 它包括① 標(biāo)本對(duì)照 :經(jīng)確認(rèn)的陰性標(biāo)本 ? ② 試劑對(duì)照 :在 PCR反應(yīng)混合物中不加模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以監(jiān)測(cè)試劑是否污染（能控制貯存試劑可能出現(xiàn)的污染或加樣器被 DNA模板的氣溶膠污染）。 2022/5/26 PCR法獲取目的基因 32 ? 合理分隔實(shí)驗(yàn)室 :將樣品的處理、配制 PCR反應(yīng)液、PCR循環(huán)擴(kuò)增及 PCR產(chǎn)物的鑒定等步驟分區(qū)或分室進(jìn)行，特別注意樣本處理及 PCR產(chǎn)物的鑒定應(yīng)與其它步驟嚴(yán)格分開(kāi)。最好能劃分①標(biāo)本處理區(qū) 。② PCR反應(yīng)液制備區(qū) 。③ PCR循環(huán)擴(kuò)增區(qū) 。④ PCR產(chǎn)物鑒定區(qū)。其實(shí)驗(yàn)用品及吸樣槍?xiě)?yīng)專(zhuān)用，實(shí)驗(yàn)前應(yīng)將實(shí)驗(yàn)室用紫外線消毒以破壞殘留的 DNA或RNA。 ? 吸樣槍 :吸樣槍污染是一個(gè)值得注意的問(wèn)題。由于操作時(shí)不慎將樣品或模板吸入槍內(nèi)或粘上槍頭是一個(gè)嚴(yán)重的污染源，因而加樣或吸取模板時(shí)要十分小心。吸樣要慢，吸樣時(shí)盡量一次性完成，忌多次抽吸，以免交叉污染或產(chǎn)生氣溶膠污染。 2022/5/26 PCR法獲取目的基因 33 ? 預(yù)混和分裝 PCR試劑 :所有的 PCR試劑都應(yīng)小量分裝，如有可能， PCR反應(yīng)液應(yīng)預(yù)先配制好，然后小量分裝， 20℃ 保存。以減少重復(fù)加樣次數(shù)，避免污染機(jī)會(huì)。另外， PCR試劑， PCR反應(yīng)液應(yīng)與樣品及 PCR產(chǎn)物分開(kāi)保存，不應(yīng)放于同一冰盒或同一冰箱。 ? 防止操作人員污染，使用一次性手套、吸頭，小離心管應(yīng)一次性使用。 ? 設(shè)立適當(dāng)?shù)年?yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照。 2022/5/26 PCR法獲取目的基因 34 ? 減少 PCR循環(huán)次數(shù)， 只要 PCR產(chǎn)物達(dá)到檢測(cè)水平就適可而止。 ? 選擇質(zhì)量好的 Eppendorf管， 以避免樣本外溢及外來(lái)核酸的進(jìn)入，打開(kāi)離心管前應(yīng)先離心，將管壁及管蓋上的液體甩至管底部。開(kāi)管動(dòng)作要輕，以防管內(nèi)液體濺出。 2022/5/26 PCR法獲取目的基因 35 本實(shí)驗(yàn)以含有小鼠基因 T10 的質(zhì)粒pCMVMycT10為模板 ， 擴(kuò)增約 800bp的產(chǎn)物 。 2022/5/26 PCR法獲取目的基因 36 ?PCR儀 、 臺(tái)式離心機(jī) 、 滅菌的微量離心管 、 凝膠電泳系統(tǒng)等 ?TaKaRa Taq (5U/181。 l) 10 PCR緩沖器 (含 Mg 2+) dNTP混合 (各 mmol/L) 模板 (10ng， 質(zhì)粒 ) 引物 （ P1和 P2, 10 mmol/L) 實(shí)驗(yàn)儀器及材料 10 PCR緩沖液： (100 mmol/L TrisHCl, , 500 mmol/L KCl, 15mmol/L MgCl2) 2022/5/26 PCR法獲取目的基因 37 Insert EcoR1 Xho1 pCMVMycT10 2022/5/26 PCR法獲取目的基因 38 P1: 5’TTCCAAGCTTCACCATGGCATCAATG CAGAAG C 保護(hù)性堿基 Hind III Tm=4（ G＋ C）＋ 2（ A＋ T）＝ 4 12＋ 2 11＝ 70 ℃ . P2: 5’TCGCGGATCCAGTGGCAG