cr技術(shù)及應(yīng)用jyhppt課件(編輯修改稿)
2025-06-01 12:06 本頁面
【文章內(nèi)容簡介】 10 buffer： 1 30 / 10 = 3μl MgCl2: 30 / 25 = dNTPs: 30 / 10 = 引物 P： 30 2 / 10 = Taq 酶 (5U/μl)： 1 / 5 = 模板： 1μl 水： =21μl PCR反應(yīng)體系： 30ul 四、 PCR反應(yīng)條件優(yōu)化： 溫度、循環(huán)參數(shù)： ⑴ 變性溫度和時間： 保證模板 DNA解鏈完全是保證整個 PCR擴(kuò)增成功的關(guān)鍵。 加熱 90～ 95℃ ， 30 ～ 60 s，再復(fù)雜的 DNA分子也可變性為單鏈。根據(jù)模板 DNA復(fù)雜程度，可以調(diào)整變性溫度和時間。一般情況下選擇 94 ℃ 30 ″ ，可使各種復(fù)雜的 DNA分子完全變性。 溫度過高或高溫持續(xù)時間過長，可對 Taq酶活性和 dNTP分子造成損害。 四、 PCR反應(yīng)條件優(yōu)化： ⑵ 復(fù)性溫度和時間： PCR擴(kuò)增特異性取決于復(fù)性過程中引物與模板 的結(jié)合。 復(fù)性溫度的選擇，可根據(jù)引物的長度和 G+C含量確定，長度在 15 ～ 25 bp 之間時，復(fù)性溫度 Tm = 4 (G+C) +2 (A+T) 計算得到，一般位于 40 ～ 60℃ ，30 ～ 60 s。 復(fù)性溫度越高，產(chǎn)物特異性越高。復(fù)性溫度越低，產(chǎn)物特異性越低。 一般情況下選擇 55 ℃ 30″ ，足以使引物與模板之間完全結(jié)合。 四、 PCR反應(yīng)條件優(yōu)化： ⑶ 延伸溫度和時間： 一般位于 Taq酶最適作用溫度 70 ～ 75 ℃ 之間。 引物小于 16個核苷酸時，過高的延伸溫度不利于引 物與模板的結(jié)合，可以緩慢升溫到 70 ～ 75 ℃ 。 延伸反應(yīng)時間，可根據(jù)待擴(kuò)增片段的長度而定， 1
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