cr擴(kuò)增產(chǎn)物的分析ppt課件(編輯修改稿)
2025-06-01 12:06 本頁面
【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 裝于棕色瓶?jī)?nèi)， 4℃ 可保存二個(gè)月 材料 ? 10%過硫酸銨 – 過硫酰銨， 1克，加水至 10 ml 4℃ 可保存一周， 20℃ 可保存一個(gè)月 ? 1 TBE電泳緩沖液 ? TEMED（四甲基乙烯基二胺） 聚丙烯酰胺凝膠的制備與電泳 ? 配膠：根據(jù)分離 DNA片段的大小及需凝膠的容積，配制聚丙烯酰胺凝膠 ? 按要求裝配好垂直電泳板，兩塊玻璃板的兩側(cè)及底部用 1%的瓊脂糖封邊，防止封閉不嚴(yán)而使聚丙烯酰胺液漏出 ? 將裝好的玻璃電泳板傾斜成 45～ 60℃ 角 ? 按表 3配制所需 %濃度凝膠的毫升數(shù) ? 加入 TEMED后，立即混勻，緩緩倒入兩玻璃板間的膠床中，直到液體接近溢出時(shí)為止 聚丙烯酰胺凝膠的制備與電泳 ? 立即插入適當(dāng)?shù)氖嶙樱芮凶⒁夥乐故猃X下產(chǎn)生氣泡，用一有力 的夾將梳子夾在一邊的玻璃板上，然后將玻璃板斜靠在物體上，使成 10176。 角，可減少液體泄漏的機(jī)會(huì) ? 室溫聚合一小時(shí)后，將玻璃板插入電泳槽中，上緊，倒入 TBE緩沖液 聚丙烯酰胺凝膠的制備與電泳 ? 小心取出梳子，立即用緩沖液沖洗加樣孔，因?yàn)槭嶙尤〕龊?，梳子上吸附的及凝膠頂部未聚合的丙烯酰胺會(huì)流入加樣孔內(nèi)聚合，產(chǎn)生不規(guī)則的表面，將導(dǎo)致以后 DNA電泳帶型不規(guī)則 ? 將 DNA樣品與適量的載樣緩沖液混勻后，加到樣品孔內(nèi)，加樣時(shí)不要產(chǎn)生氣泡 聚丙烯酰胺凝膠的制備與電泳 ? 接好電極，電壓為 18V/cm，進(jìn)行電泳 ? 電泳畢，切斷電源，取出膠床板，小心移去一塊玻璃板，讓凝膠吸附在另一塊玻璃板上，浸入含 ， 15～30min后取出水洗，紫外儀下觀察結(jié)果 ? 聚丙烯酰胺凝膠電泳只能檢出 10ng以上量的 DNA條帶（要求更高的靈敏度，可用銀染） 電泳結(jié)果分析 ? DNA Marker – λ DNA – 人工片段 ? 100 bp ladder 酶切分析 ? 根據(jù) PCR產(chǎn)物中限制性內(nèi)切酶的位點(diǎn)，用相應(yīng)的酶進(jìn)行酶切 ? 酶切產(chǎn)物電泳分離后，獲得符合理論的片段 ? 此法既能進(jìn)行產(chǎn)物的鑒定，又能對(duì)靶基因分型，還能進(jìn)行變異性研究 分子雜交 ? 檢測(cè) PCR產(chǎn)物特異性的有力證據(jù) ? 檢測(cè) PCR 產(chǎn)物堿基突變的有效方法 ? 主要的雜交 – Southern印跡雜交 –斑點(diǎn)雜交 Southern印跡雜交： ? 在兩引物之間另合成一條寡核苷酸鏈并作標(biāo)記（探針） ? 與 PCR 產(chǎn)物雜交 ? 此法既可作特異性鑒定，又可以提高檢測(cè) PCR產(chǎn)物的靈敏度，還可知其分子量及條帶形狀，主要用于科研。 斑點(diǎn)雜交： ? 將 PCR 產(chǎn)物點(diǎn)在硝酸纖維素膜或尼龍膜薄膜上 ? 寡核苷酸探針雜交 ? 觀察有無著色斑點(diǎn) ? 主要用于 PCR產(chǎn)物特異性鑒定及變異分析 RDB檢測(cè) ?地中海貧血突變基因 29（ A?G） 28（ A?G） 17（ A?T， AAG ? TAG） βE （ CD26 GAG ? AAG） IVSI1（
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