cr技術(shù)及注意事項(xiàng)ppt課件(編輯修改稿)
2025-06-01 12:06 本頁(yè)面
【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 濃度過(guò)高可降低 PCR擴(kuò)增的特異性，濃度過(guò)低則影響 PCR擴(kuò)增產(chǎn)量甚至使 PCR擴(kuò)增失敗而不出擴(kuò)增條帶。 ? 溫度： ? 變性溫度：達(dá)不到變性溫度就不會(huì)產(chǎn)生單鏈 DNA模板， PCR也就不會(huì)啟動(dòng)。變性溫度低則變性不完全， DNA雙鏈會(huì)很快復(fù)性，因而減少產(chǎn)量。一般取90～ 95℃ 。樣品一旦到達(dá)此溫度宜迅速冷卻到退火溫度。 DNA變性只需要幾秒種，時(shí)間過(guò)久沒(méi)有必要；反之，在高溫時(shí)間應(yīng)盡量縮短，以保持 Taq DNA聚合酶的活力，加入 Taq DNA聚合酶后最高變性溫度不宜超過(guò) 95℃ 。 ? 退火溫度：溫度高特異性強(qiáng)，但過(guò)高則引物不能與模板牢固結(jié)合， DNA擴(kuò)增效率下降；溫度低產(chǎn)量高，但過(guò)低可造成引物與模板錯(cuò)配，非特異性產(chǎn)物增加。一般先由 37℃ 反應(yīng)條件開(kāi)始，設(shè)置一系列對(duì)照反應(yīng)，以確定某一特定反應(yīng)的最適退火溫度。 ? 延伸溫度：引物延伸溫度溫度的選擇取決于 Taq DNA聚合酶的最適溫度。一般取 70～ 75℃ ，在 72℃ 時(shí)酶催化核苷酸的標(biāo)準(zhǔn)速率可達(dá) 35～ 100個(gè)核苷酸 /秒。每分鐘可延伸 1kb的長(zhǎng)度，其速度取決于緩沖溶液的組成、 pH值、鹽濃度與DNA模板的性質(zhì)。 ? 循環(huán)數(shù)：循環(huán)數(shù)過(guò)少， PCR產(chǎn)物得率低；循環(huán)數(shù)過(guò)多，增加非特異性。循環(huán)次數(shù)常規(guī) PCR一般為 25～ 40個(gè)周期。在保證產(chǎn)物得率前提下，應(yīng)盡量減少循環(huán)次數(shù)。 ? Realtime Quantitative PCR Detecting System QPCR ? 實(shí)時(shí)檢測(cè)（在對(duì)數(shù)擴(kuò)增時(shí)期）而不是終點(diǎn)檢測(cè) ? 敏感性高 ? 需要樣品少 ? 特異性高（ Taqman） ? 精確定量 Realtime qPCR和常規(guī) PCR的區(qū)別 ? 基線（ Base Line）：指在 PCR擴(kuò)增反應(yīng)的最初幾個(gè)循環(huán)里，熒光信號(hào)變化不大，接近于一條直線。這樣的直線，即是基線。 熒光域值（ threshold ）：一般是指 PCR 反應(yīng)的前 15 個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)，這是作為熒光本底信號(hào)。熒光域值的缺省設(shè)置是 315 個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)的標(biāo)準(zhǔn)偏差的 10 倍。設(shè)定在 PCR擴(kuò)增的指數(shù)期。 ? Ct 值：是指每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)到達(dá)設(shè)定的域值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。 Ct 值與起始模板的關(guān)系：研究表明，每個(gè)模板的 Ct 值與該模板的起始拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)存在線性關(guān)系，起始拷貝數(shù)越多， Ct 值越小。 ? 擴(kuò)增曲線：在 PCR過(guò)程中，以循環(huán)數(shù)為橫坐標(biāo)，實(shí)時(shí)熒光信號(hào)強(qiáng)度為縱坐標(biāo)所做的曲線。 ? 該技術(shù)以美國(guó) ABI 公司為代表。 PCR 擴(kuò)增時(shí)，在加入一對(duì)引物的同時(shí)加入一個(gè)特異性的熒光探針。該探針為一直線型的寡核苷酸，兩端分別標(biāo)記一個(gè)熒光報(bào)告基團(tuán)和一個(gè)熒光淬滅基團(tuán)，探針完整時(shí)，報(bào)告基團(tuán)發(fā)射的熒光信號(hào)被淬滅基團(tuán)吸收， PCR 儀檢測(cè)不到熒光信號(hào)； PCR 擴(kuò)增時(shí)（在延伸階
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