cr質控及問題分析ppt課件(編輯修改稿)
2025-06-01 12:06 本頁面
【文章內容簡介】 PCR ? 適當降低模板或引物濃度 ? 適當提高退火溫度或使用二階段溫度法 ? 減少循環(huán)次數(shù) PCR常見問題之三 拖尾 現(xiàn)象： 產物在凝膠上呈 Smear狀態(tài) M 1 2 原 因 對策 ? 模板不純 ? 退火溫度偏低 ? 循環(huán)次數(shù)過多 ? 純化模板 ? 適當提高退火溫度 ? 減少循環(huán)次數(shù) PCR常見問題之四 假陽性 現(xiàn)象：空白對照出現(xiàn)目的擴增產物 原 因 靶序列或擴增產物的 交叉污染 對策 ? 操作時應小心輕柔，防止將靶序列吸入加樣槍內或濺出離心管外； ? 除酶及不能耐高溫的物質外，所有試劑或器材均應 高壓消毒 。所用離心管及加樣槍頭等均應一次性使用。 ? 各種試劑最好先進行分裝，然后低溫貯存。 提高 PCR反應特異性策略 ? 巢式 PCR（ NestPCR） ? 遞減 PCR（ TouchDown PCR） ? 熱啟動 PCR（ HotStart PCR） ? 使用 PCR增強劑 策略之一巢式 PCR PF1 PR1 PF2 PR2 ? 巢式 PCR的使用降低了擴增多個靶位點的可能性，因為同多套引物都互補的靶序列很少。 ? 巢式 PCR可以增加有限量靶序列（如稀有 mRNA）的靈敏度，并且提高了困難PCR（ 如 539。 RACE）的特異性。 策略之二遞減 PCR ? 遞減 PCR通過在 PCR的前幾個循環(huán)使用嚴謹?shù)耐嘶饤l件提高特異性。循環(huán)設在比估算的Tm高大約 5℃ 的退火溫度下開始，然后每個循環(huán)降低 12℃ ,直到退火溫度低于 Tm 5℃ 。 ?特異性最高的目的模板會被優(yōu)先擴增，這些產物在隨后的循環(huán)中繼續(xù)擴增占據(jù)優(yōu)勢。 ?遞減 PCR對于那些不了解引物和目的模板同源性程度的方法更為有用，如 AFLP、 DNA指紋分析等。 策略之三熱啟動 PC
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