【正文】 ，并且提高了困難PCR（ 如 539。 ?反應(yīng)循環(huán)數(shù)不夠； ?檢測(cè)熒光信號(hào)步驟有誤； ?引物、探針設(shè)計(jì)不佳或降解； ?模板量少或降解。 熒光定量 PCR關(guān)鍵問題 擴(kuò)增曲線 ： 一般任意引物對(duì) PCR常見 30個(gè)循環(huán)就有嚴(yán)重 PD非特異性擴(kuò)增 (左圖 )。 原 因 對(duì)策 ? 引物特異性差 ? 模板或引物濃度過高 ? 退火溫度偏低 ? 循環(huán)次數(shù)過多 ? 重新設(shè)計(jì)引物或者使用巢式 PCR ? 適當(dāng)降低模板或引物濃度 ? 適當(dāng)提高退火溫度或使用二階段溫度法 ? 減少循環(huán)次數(shù) PCR常見問題之三 拖尾 現(xiàn)象： 產(chǎn)物在凝膠上呈 Smear狀態(tài) M 1 2 原 因 對(duì)策 ? 模板不純 ? 退火溫度偏低 ? 循環(huán)次數(shù)過多 ? 純化模板 ? 適當(dāng)提高退火溫度 ? 減少循環(huán)次數(shù) PCR常見問題之四 假陽性 現(xiàn)象：空白對(duì)照出現(xiàn)目的擴(kuò)增產(chǎn)物 原 因 靶序列或擴(kuò)增產(chǎn)物的 交叉污染 對(duì)策 ? 操作時(shí)應(yīng)小心輕柔，防止將靶序列吸入加樣槍內(nèi)或?yàn)R出離心管外； ? 除酶及不能耐高溫的物質(zhì)外，所有試劑或器材均應(yīng) 高壓消毒 。 RACE）的特異性。 ?擴(kuò)增片段過長(zhǎng)： 100~200bp。 常規(guī)終末 PCR問題 : 同一樣本重復(fù)復(fù) 48管反應(yīng) PCR終末檢測(cè)或平臺(tái)期檢測(cè)變化非常大 ,無法精確定量 (左圖 )。 PCR體系 問題、原因分析及其解決方案 提高 PCR反應(yīng)特異性的策略 臨床 PCR檢測(cè)的常見問題 實(shí)時(shí)熒光 PCR定量 檢測(cè)的 關(guān)鍵 問題 PCR體系內(nèi)的常見問題、原因分析及其對(duì)策 PCR標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)體系 ? DNA模板 ? 引物 ? 反應(yīng)緩沖液 ? Mg 2＋ 濃度 ? dNTPs ? dH2O ? 耐熱