cr的種類及應(yīng)用ppt課件(編輯修改稿)
2025-02-04 00:23 本頁面
【文章內(nèi)容簡介】 分子長度不超過23Kb,經(jīng)連接后環(huán)化成環(huán)狀分子 3. 按靶序列設(shè)計的一對向外引物同靶序列 5， 端互補序列退火結(jié)合，其延伸方向如圖中箭頭所指 4. 經(jīng) PCR擴增產(chǎn)生的主要是線性雙鏈 DNA分子，它是由左側(cè)的序列和右側(cè)序列首位連接而成，其接點就是限制酶的識別位點 2022/2/3 12 應(yīng)用 ： 利用反向 PCR可對未知序列擴增后進行分析，探索鄰接已知 DNA片段的序列，并可將僅知部分序列的全長 cDNA進行分子克隆，建立全長的 DNA探針。 應(yīng)用于染色體步移、轉(zhuǎn)位因子和已知序列 DNA旁側(cè)病毒整合位點分析等研究。 局限性 ： 需要從許多酶中選擇限制酶，或者說必須選擇一種合適的酶進行酶切才能得到合理大小的 DNA片段。這種選擇不能在非酶切位點切斷靶 DNA。 大多數(shù)有核基因組含有大量中度和高度重復(fù)序列，而在YAC或 Cosmid中的未知功能序列中有時也會有這些序列，這樣，通過反向 PCR得到的探針就有可能與多個基因序列雜交。 2022/2/3 13 就像任何 DNA一樣， PCR的雙鏈 DNA產(chǎn)物也可以供序列測定使用。 然而，按照 Sanger雙脫氧末端鏈終止法測定 DNA的核苷酸序列，最好是使用單鏈模版 DNA。 現(xiàn)在已經(jīng)發(fā)展出了一種專門用于制備單鏈 DNA的技術(shù) — 不對稱 PCR技術(shù)。 這種技術(shù)，除了使用的兩種引物濃度相差 100倍以外，其他的方面跟常規(guī) PCR技術(shù)沒有什么本質(zhì)的區(qū)別。 不對稱 PCR 2022/2/3 14 基本原理： PCR擴增所用的兩條引物中，濃度受限制的只及高濃度的 1%（或 2%）。 經(jīng)過 PCR循環(huán)直到限制引物耗盡之前，擴增的引物是雙鏈的 DNA序列。而后，反應(yīng)混合物中的另一種高濃度的引物，則利用限制引物合成的 DNA鏈做模板，繼續(xù)引導(dǎo) DNA合成。 這樣模板鏈繼續(xù)再循環(huán)，由高濃度的引物合成的 DNA要比限制引物多得多，而且仍保持單鏈狀態(tài)。 2022/2/3 15 不對稱 PCR的原理 多重 PCR 一般 PCR僅應(yīng)用一對引物，通過 PCR擴增產(chǎn)生一個核酸片段，主要用于單一致病因子等的鑒定 .多重 PCR(multiplex PCR)，又稱多重引物 PCR或復(fù)合 PCR，它是在同一 PCR反應(yīng)體系里加上二對以上引物，同時擴增出多個核酸片段的 PCR反應(yīng)，其反應(yīng)原理，反應(yīng)試劑和操作過程與一般 PCR相同 多重 PCR的試驗步驟 同一般的 PCR操作相同，只是反應(yīng)中所加入的是多對引物而不是一對引物。 1. DNA提?。?DNA提取可以用 DNA提取試劑盒或?qū)嶒炇页Ｓ玫囊恍?DNA提取方法進行。 2. DNA定量：用紫外分光光度計進行 DNA含量測定。 3. 多重 PCR擴增：反應(yīng)體系可以選定為 20μl ， 50μl 等，反應(yīng)體系中含有： DNA模板， Mg++， dNTP， Taq DNA聚合酶，各種引物等。根據(jù)實驗要求，設(shè)計合適的循環(huán)參數(shù)。在設(shè)計循環(huán)參數(shù)時要注意兩個原則：一是退火溫度要足夠高。這是因為，多重 PCR技術(shù)是在擴增體系中加入了多對引物同時進行擴增，這樣就會由于錯配而產(chǎn)生一些非特異性的擴增產(chǎn)物，增高退火溫度，可以有效的減少非特異性擴增產(chǎn)物的生成；二是循環(huán)參數(shù)要盡量少，以利于檢測擴增產(chǎn)物。多重 PCR在一個反應(yīng)體系中同時擴增多個 DNA段，
教學(xué)課件相關(guān)推薦
鄂ICP備17016276號-1