cr技術(shù)簡史ppt課件(編輯修改稿)
2025-02-04 00:23 本頁面
【文章內(nèi)容簡介】 95℃ 50℃72℃Taq Taq Taq Taq PCR的基本原理 ? PCR反應(yīng)條件 ? PCR過程 ? PCR的特點 72℃ 第 2輪結(jié)束 PCR的基本原理 ? PCR反應(yīng)條件 ? PCR過程 ? PCR的特點 模板 DNA 第 1輪擴增 第 2輪擴增 第 3輪擴增 第 4輪擴增 第 5輪擴增 第 6輪擴增 PCR的基本原理 ? PCR反應(yīng)條件 ? PCR過程 ? PCR的特點 ? 靈敏度高 (pg=1012)量級擴增到微克 (ug=106)水平 100萬個細(xì)胞中檢出一個靶細(xì)胞 3個 RFU 3個細(xì)菌 ? 簡便、快速 ， 2～ 4 小時完成擴增 ? 對標(biāo)本的純度要求低 ?血液、體腔液、洗嗽液、毛發(fā)、細(xì)胞、活組織等組織的粗提 DNA 引物設(shè)計 ： （ 1)序列應(yīng)位于高度保守區(qū)，與非擴增區(qū)無同源序列。 （ 2）引物長度以 1540 bp為宜。 （ 3） 堿基盡可能隨機分布 ， G+C占 5060%。 （ 4）引物內(nèi)部避免形成二級結(jié)構(gòu)。 （ 5）兩引物間避免有互補序列。 （ 6）引物 3’ 端為關(guān)鍵堿基； 5’ 端無嚴(yán)格限制。 3’ 5’ 3’ 5’ 限制性內(nèi)切酶的識別序列 啟動子序列 定點突變 探針標(biāo)記 1） PCR反應(yīng)成分 （ 1）模板 單、雙鏈 DNA均可。 不能混有蛋白酶、核酸酶、 DNA聚合酶抑制劑、DNA結(jié)合蛋白類。 一般 100ng DNA模板 /100?L。 模板濃度過高會導(dǎo)致反應(yīng)的非特異性增加。 PCR反應(yīng)條件 （ 2）引物濃度 ?mol/L 濃度過高易導(dǎo)致模板與引物錯配 ,反應(yīng)特異性下降。 （ 3） Taq DNA聚合酶（ thermus aquaticus) U/50 ?l 酶量增加使反應(yīng)特異性下降 。酶量過少影響反應(yīng)產(chǎn)量。 （ 4） dNTP dNTP濃度取決于擴增片段的長度 四種 dNTP濃度應(yīng)相等 濃度過高易產(chǎn)生錯誤堿基的摻入，濃度過低則降低反應(yīng)產(chǎn)量 dNTP可與 Mg2+結(jié)合，使游離的 Mg2+濃度下降，影響 DNA聚合酶的活性。 （ 5） Mg2+ Mg2+是 DNA聚合酶的激活劑。 。 Mg2+濃度過低會使 Taq酶活性喪失、 PCR產(chǎn)量下降； Mg2+過高影響反應(yīng)特異性。 Mg2+可與負(fù)離子結(jié)合，所以反應(yīng)體系中 dNTP、EDTA等的濃度影響反應(yīng)中游離的 Mg2+濃度。 2）循環(huán)參數(shù) (1)變性 使雙鏈 DNA解鏈為單鏈 95oC 2030秒 (2) 退火 溫度由引物長度和 GC含量決定。 增加溫度能減少引物與模板的非特異性結(jié)合 。降低溫度可增加反應(yīng)的靈敏性。 （ 3）延伸 7075oC， 延伸時間由擴增片段長度決定 （
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