a基因克隆的技術(shù)要點(diǎn)(編輯修改稿)
2025-02-08 06:45 本頁面
【文章內(nèi)容簡介】 4）將菌液分裝到 Ep管中，于冰上放置 10min，然后于 4 ?C下 5000r/min離心 10min。 Page ? 14 大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備 ?操作方法 5）將離心管倒置以倒盡上清液，加入 1mL冰冷的 CaCl2溶液，立即在快速混勻器上混勻，插入冰中放置 30min。 6） 4 ?C下 5000r/min離心 10min，棄上清液后，用 1mL冰冷的，插入冰中放置 30min。 7） 4 ?C下 5000r/min離心 10min，棄上清液后，用 200μL冰冷的 ，超凈工作臺中按每管 100μL分裝到 ?？梢灾苯佑米鲛D(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)，或立即放入 80?C超低溫冰柜中保藏（可存放數(shù)月）。 8）在被細(xì)菌污染的桌面上噴灑 70%乙醇，擦干桌面。 Page ? 15 外源 DNA的重組與轉(zhuǎn)化 ?DNA的體外連接重組 ?其本質(zhì)是一個(gè)酶促反應(yīng)過程，即在一定的條件下， DNA連接酶催化兩個(gè)雙鏈 DNA片段的 5’端磷酸和 3’端羥基之間相互作用，形成磷酸二酯鍵的過程。 ?DNA連接酶有兩種： T4噬菌體 DNA連接酶 大腸桿菌 DNA連接酶。 ?其中 T4 DNA連接酶 對作用底物要求低，能更有效地連接 DNA的平末端，應(yīng)用更為廣泛。 Page ? 16 外源 DNA的重組與轉(zhuǎn)化 ?T4 DNA 連接酶催化 DNA 連接反應(yīng)分為 3 步： ?首先， T4 DNA 連接酶與輔因子 ATP通過 T4 DNA 連接酶中亮氨酸的氨基與 ATP中的磷酸作用形成酶 ATP復(fù)合物； ?然后，酶 ATP復(fù)合物活化 D
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