【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 ： 在多克隆位點(diǎn)的上、下游，分別裝有強(qiáng)化外源基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄、翻譯、純化元件，使外源基因能在受體細(xì)胞中 高效表達(dá) 、便于下游 純化 。 pGEM3Z： 裝有 2個(gè)噬菌體的強(qiáng)啟動(dòng)子 裝有多克隆位點(diǎn) (MCS) 正選擇顏色標(biāo)記 lacZ’ 用于外源基因的高效表達(dá) 注意： T7和 SP6啟動(dòng)子 特異性地由噬菌體 RNA聚合酶識(shí)別 ， 相應(yīng)的受體菌需表達(dá)噬菌體 RNA聚合酶 ， 如BL21(表達(dá) T7 RNA聚合酶 )。 MCS lacZ’ PT7 ori Ampr 2,743 bp pGEM3Z PSP6 pET3a： pET28a： 只有含啟動(dòng)子或終止子的外源 DNA插入載體的合適位點(diǎn) ， 報(bào)告基因才能表達(dá) ， 表達(dá)量的高低直接反映表達(dá)調(diào)控元件的強(qiáng)弱 。 探針質(zhì)粒： 用于 篩選表達(dá)調(diào)控元件 ， 如啟動(dòng)子 、 終止子 。 通常裝有一個(gè)可定量檢測(cè)表達(dá)程度的 報(bào)告基因 （ 如抗生素抗性基因 ） ， 但缺少相應(yīng)的啟動(dòng)子或終止子 ， 因此本身不能表達(dá)報(bào)告基因 。 質(zhì)粒 DNA的分離純化 氯化銫密度梯度離心法 堿裂解法 沸水浴法 氯化銫密度梯度離心法 用含有 EDTA的緩沖液懸浮菌體 加溶菌酶裂解細(xì)菌細(xì)胞壁 加 CsCl和溴化乙錠 超速離心過夜 proteins ocDNA LDNA cccDNA RNAs 在紫外燈下吸取 cccDNA 沸水浴法 用含 EDTA和 Triton X100的緩沖液懸浮菌體 加溶菌酶裂解細(xì)菌細(xì)胞壁 沸水浴 40 sec 離心，用無菌牙簽挑去沉淀物 乙醇或異丙醇沉淀質(zhì)粒 DNA 堿裂解法 將菌體懸浮在含 EDTA的緩沖液中 加 NaOH與 SDS混合液，去膜釋放內(nèi)含物 加溶菌酶裂解細(xì)菌細(xì)胞壁 加高濃度 NaAc溶液，沉淀去除染色體、大部分蛋白質(zhì) 離心取上清，酚 氯仿處理，去除痕量蛋白質(zhì)、核酸酶 乙醇或異丙醇沉淀水相質(zhì)粒 RNase處理殘余 RNA 氯化銫密度梯度離心法 質(zhì)粒純度高、周期長(zhǎng)、設(shè)備要求高、溴乙錠污染； 堿裂解法 質(zhì)粒純度低、快速、操作簡(jiǎn)便； 沸水浴法 質(zhì)粒純度、操作周期介于氯化銫法和沸水浴法之間。 （三）噬菌體或病毒 DNA 噬菌體 (bacteriophage)或病毒 (virus)是一類非細(xì)胞微生物 ， 能 高效率高特異性 地侵染宿主細(xì)胞 ， 然后或 自主復(fù)制繁殖 ， 或整合入宿主基因組中潛伏起來 ， 而且在一定條件下這兩種狀態(tài)會(huì)相互轉(zhuǎn)化 。 噬菌體吸附在 噬菌體釋放、菌體裂解 T4噬菌體 The DNA is about 3,500 times longer than the viral particle. The electron micrograph of the single linear DNA molecule of bacteriophage T2(about 182,000 bp)。 可使外源基因高效導(dǎo)入受體細(xì)胞。 可使外源基因在受體細(xì)胞中高效擴(kuò)增。 噬菌體或病毒 DNA能被開發(fā)為基因工程載體的原因： 高效感染性 自主復(fù)制繁殖性 ?噬菌體 DNA 生物結(jié)構(gòu)： ?DNA為雙鏈線性 DNA，長(zhǎng) kb； ?噬菌體是 ； ?噬菌體由外殼包裝蛋白和 ?DNA組成； ?噬菌體能包裝原 ?DNA長(zhǎng)度的75105%，約 3751kb； cos位點(diǎn) 對(duì)包裝至關(guān)重要。 ?DNA兩端各有 12個(gè)核苷酸組成的 5’突出粘性末端 (cohensiveend)， 5’ TCCAGCGGCGGGG 3’ 3’ CCCGCCGCTGGA 5’ ?DNA 二者的核苷酸 序列互補(bǔ)， 進(jìn)入宿主細(xì)胞后 ， 粘性末端連接成環(huán)狀 DNA分子 ， 此末端稱為 cos位點(diǎn) (cohensiveend site)。 5’ TCCAGCGGCGGGG 3’ 3’ CCCGCCGCTGGA 5’ cos位點(diǎn) 頭部合成基因 尾部合成基因 溶菌控制基因 晚期控制基因 DNA合成控制基因 阻遏基因 早期控制基因 阻遏基因 重組基因 刪除與整合基因 ? DNA 48,502bp ?DNA上至少有 61個(gè)基因 溶菌周期 噬菌體的生活周期 溶源周期 烈性噬菌體 (virulent phage)只有溶菌周期。 溫和噬菌體 (temperate phage)既有溶源周期 ， 又有溶菌周期 。 溶菌周期： 吸附 LamB受體 注入 復(fù)制 包裝 裂解 感染細(xì)菌后 ， 立即在菌體內(nèi)復(fù)制和合成蛋白質(zhì)外殼 ， 重新組裝成噬菌體顆粒 ， 并導(dǎo)致細(xì)菌細(xì)胞裂解 ， 釋放出大量子代噬菌體 。 溶源周期： 整合到細(xì)菌染色體的 DNA隨細(xì)菌染色體復(fù)制而復(fù)制 。 感染細(xì)菌后 ， 將自己的 DNA整合到細(xì)菌的染色體 DNA中 ， 形成原噬菌體 (prophage)， 這一過程稱為 溶源化(lysogenization)。 經(jīng)過若干世代后 ， 才從細(xì)菌染色體上脫離下來 ， 復(fù)制 、 合成噬菌體蛋白 ， 組裝成新的噬菌體， 導(dǎo)致菌體細(xì)胞裂解 。 ?噬菌體感染 ， 除能裂解細(xì)胞（ 溶菌狀態(tài) ） 外 ， 還能將其 DNA整合到宿主細(xì)胞染色體 DNA上 ， 而不產(chǎn)生子代噬菌體顆粒 ， 即 溶源狀態(tài) 。 整合由 ?DNA上 cI和 int基因的產(chǎn)物激活 ，這兩個(gè)基因的開放與關(guān)閉又取決于宿主細(xì)胞本身的性質(zhì) 。 在宿主生理狀態(tài)好 ， 即營養(yǎng)條件適合 、 菌體代謝旺盛的情況下 ， cI基因關(guān)閉 ， 進(jìn)入溶菌狀態(tài)；在宿主生理狀態(tài)差的情況下 ， cI基因開放 ， 進(jìn)入溶源狀態(tài) 。 DNA重組技術(shù)需 ?噬菌體進(jìn)入 狀態(tài) 。 可根據(jù)需要 ， 改變 ?DNA或宿主細(xì)胞的性質(zhì) ， 使噬菌體或處于溶菌狀態(tài) ， 或處于溶源狀態(tài) 。 溶菌 感染早期：雙鏈進(jìn)行 ?型復(fù)制。 ?DNA的復(fù)制： ?型復(fù)制 滾環(huán)復(fù)制 感染晚期：?jiǎn)?dòng)滾環(huán)復(fù)制機(jī)制。 形成多聯(lián)體 ?DNA分子 ， 必須在 cos 位點(diǎn) 被切斷成單體分子才能被包裝 。 ?DNA載體的構(gòu)建 野生型 ?噬菌體 能包裝原 ?DNA長(zhǎng)度的75105%（ 3751kb） ， 本身長(zhǎng)度為 ， 只有當(dāng)插入的外源 DNA片段 ≤ ， 才能被包裝成有感染力的噬菌體顆粒 。 縮短野生型