基因工程-克隆載體09(編輯修改稿)
2025-02-26 10:54 本頁(yè)面
【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 均為絲狀，親緣關(guān)系密切，長(zhǎng)度均為 ，單鏈環(huán)狀正股DNA分子 優(yōu)點(diǎn)： 胞內(nèi)為雙鏈，胞外為單鏈。 復(fù)制型 為雙鏈環(huán)狀 DNA，可按細(xì)菌質(zhì)粒使用。 單鏈可用作測(cè)序、制備探針、定點(diǎn)誘變 。無論雙、單鏈，均不需包裝即可感染大腸桿菌，體內(nèi)包裝不受DNA分子大小限制噬菌粒 （ phagemid, phasmid） 質(zhì)粒載體和單鏈?zhǔn)删w載體結(jié)合而成的載體 優(yōu)點(diǎn)：分子量小（ ）、克隆能力大（ 10Kb）、穩(wěn)定遺傳以及 用來制備單鏈或雙鏈 DNA（有輔助病毒存在時(shí)，載體就以噬菌體的模式增殖，產(chǎn)生單鏈 DNA。若無 輔助 病毒存在，則以質(zhì)粒的形式復(fù)制，產(chǎn)生雙鏈 DNA）等pEMBL(f1與 pUC8組成 ) pBluescript(f1與 pBR322組成 )。pGEMT Easy (3kb)，俗稱 “T 載體 ” （pGEM與 f1組成）pUC118/119(M13與 pUC18組成 )噬菌體的受體菌 λ 噬菌體的常用宿主菌均為大腸桿菌，但不同性質(zhì)的載體應(yīng)選擇不同 遺傳標(biāo)記 的菌株。應(yīng)查有關(guān)資料 M13最常用的宿主菌為 JM系列（ JM101～110）酵母人工染色體 ( YAC) 真正的人工染色體要在寄主細(xì)胞中穩(wěn)定地復(fù)制并遺傳下去 ,必須具備三個(gè)元件 : 復(fù)制起始區(qū) (origin of replication) ,參與染色體 DNA 復(fù)制起始結(jié)構(gòu)的形成 。著絲粒(centromere) ,負(fù)責(zé)染色體向子細(xì)胞的傳遞 。端粒 (telomere) ,對(duì)染色體 DNA 兩個(gè)末端起封口和保護(hù)作用 YAC 能容載長(zhǎng)達(dá) 900～ 1000kb片段。 缺點(diǎn) :1) 存在 嵌合 現(xiàn)象 (chimerism) ,即一個(gè) YAC克隆中的插入子可能來自兩個(gè)或多個(gè)不同的片段 ,嵌合體的比例達(dá)到 10 %～ 50 % ,這種現(xiàn)象使染色體步行 (chromosome walking) 和基因分離難度加大 。2) 穩(wěn)定性差 ,插入片段存在重排和丟失現(xiàn)象。3) 插入片段的 分離和純化困難 。4) 轉(zhuǎn)化效率低 。細(xì)菌人工染色體 ( BAC) BAC載體系統(tǒng)是在大腸桿菌 F 因子的基礎(chǔ)上發(fā)展而來的 ,F 因子具有穩(wěn)定遺傳的特點(diǎn) ,其復(fù)制是嚴(yán)緊型的 ,在每個(gè)細(xì)胞中僅有 1～ 2 個(gè)拷貝 ,減小了插入片段發(fā)生重組的機(jī)率 容載能力一般為 100～ 350kb1) 以大腸桿菌為寄主 ,轉(zhuǎn)化率高 ,構(gòu)建更容易。2) BAC 載體以環(huán)型超螺旋狀態(tài)存在 ,從大腸桿菌中提取較方便3) BAC 的復(fù)制子來源于 F 因子 ,可 穩(wěn)定遺傳 ,嵌合及重組現(xiàn)象少4) 克隆位點(diǎn)的兩側(cè)具有 T7 和 Sp6 聚合酶啟動(dòng)子 ,可以用于轉(zhuǎn)錄獲得 RNA 探針或直接用于插入片段的末端測(cè)序優(yōu)點(diǎn)源于 P1 的人工染色體 (PAC) PAC 載體以 F 因子和噬菌體 P1 為基礎(chǔ)構(gòu)建 ,兼有二者的特點(diǎn) ,通過電轉(zhuǎn)化可將 PAC 導(dǎo)入大腸桿菌。 特點(diǎn)： PAC 載體可以插入約 300kb 的外源片段 ,插入的外源 DNA 沒有明顯的嵌合和缺失現(xiàn)象 ,可以穩(wěn)定遺傳及高效擴(kuò)增。 雙元細(xì)菌人工染色體 (binary BAC ,BIBAC) 和可轉(zhuǎn)化人工染色體 ( transformationpetent artificial Chromosome ,TAC) ,這些載體不僅具有較大的克隆容量 ,而且具備了直接 轉(zhuǎn)化植物 進(jìn)行功能互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)的功能。 穿梭功能結(jié)合 BAC 載體和 Ti 質(zhì)粒的特點(diǎn)表達(dá)載體基本成分 ① 復(fù)制起點(diǎn) ② 篩選基因 ③ MCS ④ 參與控制轉(zhuǎn)錄與轉(zhuǎn)譯的遺傳元件 啟動(dòng)子、轉(zhuǎn)錄終止子 轉(zhuǎn)譯起始序列、轉(zhuǎn)譯增強(qiáng)子、轉(zhuǎn)譯終止子病毒載體 動(dòng)物病毒載體的特點(diǎn) 真核表達(dá)問題：基因表達(dá)自主感染、整合：轉(zhuǎn)基因基因治療重組疫苗：無毒、多價(jià)、多聯(lián) 種類繁多，優(yōu)勢(shì)突出動(dòng)物病毒載體的種類 昆蟲病毒載體 哺乳動(dòng)物病毒載體 昆蟲病毒載體 多角體病毒（桿狀病毒）載體（ NPV載體） 轉(zhuǎn)移載體。 桿狀病毒為環(huán)狀 dsDNA,(30kb),其包涵體稱為 多角體 苜蓿丫紋夜蛾核型多角體病毒 (AcMNPV) 秋粘蟲 家蠶核多角體病毒 (BmNPV)家蠶 棉鈴蟲核型多角體病毒 (HaNPV)棉鈴蟲baculovirus expres
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