植物基因克隆的載體(編輯修改稿)
2025-05-28 06:09 本頁(yè)面
【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 2系列 pBR322的結(jié)構(gòu) pSP2124質(zhì)粒的 Ampr基因 （ 1）元件來(lái)源 ① 復(fù)制起點(diǎn) ori pMB1系列（來(lái)源于 ColE1）的 高拷貝 型復(fù)制起點(diǎn) ② Ampr基因 ③ Tetr基因 pSC101的 Tetr 基因。 （ 2）長(zhǎng)度 4363bp （ 3）選擇標(biāo)記 氨芐青霉素和四環(huán)素抗性。 （ 4）克隆位點(diǎn) 其中 9個(gè)會(huì)導(dǎo)致 Tetr基因失活（如BamH I、 Hind Ⅲ 、 Sal I）； 3個(gè)會(huì)導(dǎo)致 Ampr基因失活（ Sca I、PvuI、 Pst I）。 24個(gè)克隆位點(diǎn)。 （ 5） pBR322的優(yōu)點(diǎn) ① 雙抗菌素抗性選擇標(biāo)記 插入失活，分兩次先后選擇： 沒(méi)有獲得載體的寄主細(xì)胞 ? 在 Amp或 Tet中 都 死亡。 獲得載體的寄主細(xì)胞 ? 在 Amp或 Tet其中之一 中死亡。 外源基因 ?BamH I Amp中存活 但在 Tet中死亡 外源基因 ?Pst I Tet中存活 但在 Amp中死亡 加入氯霉素之后，每個(gè)細(xì)胞可達(dá)1000~3000copy ④ 安全 失去了轉(zhuǎn)移蛋白基因 mob（ mobilization）。不能通過(guò)接合轉(zhuǎn)移。 ③ 高拷貝數(shù) ② 分子小，克隆能力大 載體越小越好。 10kb的 DNA在純化過(guò)程中容易斷裂。 ① 刪除 mob識(shí)別位點(diǎn) （如質(zhì)粒 pBR32 pAT153等）。 pAT153： 從 pBR322上切去 HaeII片斷，既除去了 mob識(shí)別位點(diǎn)，又增加質(zhì)粒的拷貝數(shù)。 （ 7） PBR322的改進(jìn) pBR325： 在 pBR322位點(diǎn)上接入一段來(lái)自噬菌體 PICm的 HaeII酶切片斷（帶有氯霉素抗性基因 cmlr）。 cmlr上也帶一個(gè) EcoRI位點(diǎn)。 使 EcoRI 也成為插入失活型位點(diǎn)。 ② 改造 EcoR I 位點(diǎn) （二） pUC系列 University of California的 J. Messing和 J. Vieria于 1978年，在 pBR322的基礎(chǔ)上改造而成。屬正選擇載體。 pUC pUC pUC pUCpUC1 pUC1 pUC19 pUC18/19的結(jié)構(gòu) 復(fù)制起點(diǎn)： 來(lái)自 pBR322質(zhì)粒。 Ampr基因： 來(lái)自 pBR322質(zhì)粒 lacZ的啟動(dòng)子： 來(lái)自大腸桿菌 lacZ’基因 ： 大腸桿菌 lacZ的 ?肽鏈序列， 是 LacZ 的氨基端片斷 多克隆位點(diǎn)： 10個(gè)連續(xù)的單酶切位點(diǎn)，位于 lacZ’基因的 5’端。 pUC18/19的結(jié)構(gòu) pUC18/19質(zhì)粒載體的優(yōu)點(diǎn) ① 更小的分子量： 如 pUC18為 2682bp， pUC8為2750bp。 ② 選擇方便： Xgal顯色、抗菌素雙重直接選擇。 ③ 克隆便利： 具有多克隆位點(diǎn)（ MCS），使有兩個(gè)不同粘性末端的外源 DNA方便地插入。 ④ 測(cè)序方便： pUC的 MCS與 M13噬菌體載體的 MCS完全相同，便于把外源 DNA轉(zhuǎn)移到 M13載體上測(cè)序。 選擇原理 ? Ampicillin 抗性和 lacZ的 ?肽互補(bǔ)（藍(lán)白斑）相結(jié)合。 ? 藍(lán)白斑篩選 Xgal ? （ 5Bromo4chloro3indolyl?Dgalactoside） ? 是 ?半乳糖苷酶的作用底物 ?半乳糖苷酶作用于 Xgal顯色反應(yīng) ? ?半乳糖苷酶能把無(wú)色的化合物 Xgal分解成半乳糖和一個(gè)深藍(lán)色的物質(zhì) 5溴 4氯靛藍(lán) 誘導(dǎo)物： IPTG ? IPTG是乳糖的類似物。能誘導(dǎo) lac操縱子的啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄，使 受體菌基因組中的 lacZ 的 C端部分 和 載體的 lacZ’?肽 都表達(dá)，從而互補(bǔ)。 ? 但載體 MCS上插入外源 DNA后，不能產(chǎn)生 ?肽！ lacZ的 ?肽互補(bǔ) ? ?肽（ lacZ’ 基因編碼）： ?半乳糖苷酶 N端的一段氨基酸片斷（ 1141氨基酸）。 ? lacZ只有在 4聚體的狀態(tài)下才有功能。 ? pUC質(zhì)粒 載體上的 lacZ’ 編碼的 ?肽 與這個(gè)缺失突變的 ?半乳糖苷酶“互補(bǔ)”，使它能形成 4聚體，又能分解 Xgal，產(chǎn)生藍(lán)色
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