【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 ， 其中絕大多數(shù)編碼跨膜蛋白或膜結(jié)合蛋白 。VirB蛋白中的 10個(gè)基因產(chǎn)物具有很好的跨膜拓?fù)涮匦?， 其中 3個(gè)已被確定為外膜蛋白 ， 一個(gè)為內(nèi)膜蛋白 。 因此這些蛋白可能一起在膜上形成一種類(lèi)似于細(xì)菌接合轉(zhuǎn)移時(shí)從供體菌轉(zhuǎn)至受體菌所必需的結(jié)構(gòu) ， 即接合孔 （ conjugative pole） 或性毛 （ sex pilus） ， TDNA通過(guò)這種孔由細(xì)菌進(jìn)入植物細(xì)胞 。 同時(shí) ， VirB也可能起運(yùn)輸和提供能量的作用 。 已知 VirB7在 Vir蛋白中最小 ， 含信號(hào)肽 ， 無(wú)跨膜區(qū) ，它卻能通過(guò)細(xì)菌內(nèi)膜 ， 至外膜定位 ， 它也可能是一種裂解蛋白 （ lysisprotein） ， 起部分裂解農(nóng)桿菌的作用 ， 使 T復(fù)合體從細(xì)菌細(xì)胞中運(yùn)出 ， 或因其定位在外膜上 ， 可促進(jìn)與植物細(xì)胞表面相互作用 。 VirB11基因上有 ATP結(jié)合位點(diǎn) ，最近發(fā)現(xiàn) VirB11蛋白確有 ATP酶活性 ， 因此它可能在 TDNA轉(zhuǎn)移中起提供所需能量的作用 。 四、 T鏈復(fù)合體靶向植物細(xì)胞核 目前已知 VirD2及 VirE2上有核定位信號(hào) (nuclear localizing signal,簡(jiǎn)稱(chēng) NLS)。 前已指出 ， VirD2Ｎ端 50%已足以特異的剪切 TDNA的邊界序列 ,C端 50%則含 NLS。在 VirE2中也有類(lèi)似的序列 ， 將其與 Gus融合作為報(bào)告基因 ， 證明 virE2可使融合蛋白導(dǎo)向植物細(xì)胞核 ， 但 VirE2與 VirD2相比 ， 其核定位功能較弱 。 綜上所述， VirD2可能以一種極性方向，首先將 T復(fù)合體定向至核孔，而 vir E2則作為一種促進(jìn)因子，保證很長(zhǎng)的 T復(fù)合體在進(jìn)入核孔時(shí)不受干擾。 VirD2及 VirE2蛋白上的核定位信號(hào)與動(dòng)物相似，說(shuō)明植物和動(dòng)物的這種信號(hào)從進(jìn)化上講是保守的。 五、 T鏈整合植物基因組 的分子機(jī)理 1. 整合位點(diǎn)及其特性 遺傳作圖的分析表明 ， TDNA在植物染色體中的插入是隨機(jī)的 。 它可插入任何一條植物染色體 。 但 插入位點(diǎn)常有以下特點(diǎn)： ① TDNA優(yōu)先整合到轉(zhuǎn)錄活躍的植物基因位點(diǎn)； ② TDNA與植物 DNA連接處富含 A， T堿基對(duì)； ③ 植物DNA上的插入靶位點(diǎn)與 TDNA邊界序列有一定程度的同源性 。 Matsumoto等人認(rèn)為正是由于這種同源性才使得插入的 TDNA和靶序列能互相靠近 ， 并有效地發(fā)生 DNA鏈的交換 。 非常有趣的是他們還發(fā)現(xiàn)在植物基因組靶序列附近有一段 （ dGdT） 10序列 。 這種 （ dG一 dT） 10是真核基因組中保守的高度重復(fù)序列 。 當(dāng) DNA處于負(fù)超螺旋時(shí) ， 該重復(fù)序列極易形成 ZDNA， 使位于它附近的序列部分解旋 ， 為DNA重組 、 TDNA插入提供位點(diǎn) 。 2. TDNA的整合機(jī)理 Mayerhofer等從轉(zhuǎn)化的擬南芥菜中分離并測(cè)定插入的TDNA及插入位點(diǎn)序列，發(fā)現(xiàn) TDNA的插入使得靶序列缺失 29～ 73bp。一部分整合的 TDNA片段不完整，兩端均有缺失。靶序列斷裂處與插入的 TDNA兩端有部分重疊。另一部分整合的 TDNA卻保持完整。其中一些插入的 TDNA能精確地取代植物靶序列，其右邊界與靶序列連接， TDNA左未端和靶序列裂口同源。還有一種情形則是， TDNA插入片段的未端與缺失的靶序列裂口處并無(wú)同源性，而是在其內(nèi)部有部分短片段與 TDNA未端同源。在靶序列裂口處還發(fā)現(xiàn)有 DNA序列的倒位或重復(fù)。 TDNA的整合是異常重組（ illegitimate rebination ）的結(jié)果。 TDNA右未端在靶序列的識(shí)別及連接中是必需的，TDNA左未端和兩個(gè)靶 DNA未端則參與部分配對(duì)和 DNA修復(fù)。 3. TDNA整合的遺傳效應(yīng) TDNA插入的位點(diǎn)不同 ， 可使轉(zhuǎn)基因植物具有不同的表型和遺傳特性 ， 即所謂位點(diǎn)效應(yīng) （ position effect） 。 已知 TDNA可插入多個(gè)物理位點(diǎn) 。 遺傳位點(diǎn)數(shù)一般少于或等于插入的物理位點(diǎn)數(shù) ， 這是因?yàn)榧谆墒够虿槐磉_(dá) ， 或者幾個(gè)拷貝連鎖在一起 。 多拷貝的 TDNA可插入不同的獨(dú)立位點(diǎn) ， 或可首尾串聯(lián) （ trandem） 插入同一位點(diǎn) ， 多拷貝 TDNA進(jìn)人同一植物細(xì)胞后 ， 這些拷貝之間可能相互作用 ， 導(dǎo)致基因的沉默 ， 這種現(xiàn)象現(xiàn)被稱(chēng)為共抑制 （ cosupression） 。 TDNA插入的遺傳特性： (1)TDNA的插入不引起植物 DNA大的重排 。 但多數(shù)插入會(huì)導(dǎo)致靶位點(diǎn)處小的缺失 ， 缺失多至 79個(gè)核苷酸 。 (2)另一個(gè)常見(jiàn)的結(jié)果是 ， 在 TDNA／植物 DNA連接處 ， 會(huì)有幾個(gè)至33個(gè)核苷酸的 “ 填充 ” DNA（ Filler DNA） 存在 ， 這些 “ 填充 ” DNA的序列與靠近連接處的植物 DNA序列相似 。 (3)在植物靶位處不要求有特異的序列 ， 但若在 TDNA兩端和植物靶位處之間有一段短序列 （ 5～ 10b） 同源 ， 則可以在整合中起作用 。 六、農(nóng)桿菌染色體基因?qū)?TDNA轉(zhuǎn)移的調(diào)控 目前已發(fā)現(xiàn)位于細(xì)菌染色體上的一些基因也和 TDNA的轉(zhuǎn)移有關(guān) ， 并且已經(jīng)了解它們編碼的蛋白質(zhì)的功能 。ChvA、 ChvB、 ChvC參與細(xì)菌的附著功能； Cel位點(diǎn)與細(xì)菌表面纖維絲的合成有關(guān) 。Att基因影響農(nóng)桿菌細(xì)胞表面蛋白的合成； ivr基因的突變能使農(nóng)桿菌細(xì)胞表面的脂多糖發(fā)生改變而影響農(nóng)桿菌宿主范圍； PscA和 ExoC基因與多糖合成有關(guān) ， 并影響農(nóng)桿菌附著能力 。 以上這些基因的突變將使細(xì)菌表面成分發(fā)生變化 ， 從而喪失與植物細(xì)胞識(shí)別和結(jié)合的能力 。 此外 ， ChvD位點(diǎn)影響 AS對(duì)毒性區(qū)的誘導(dǎo)效率和農(nóng)桿菌的致瘤能力 。 CbvE位點(diǎn)編碼一個(gè)單糖結(jié)合蛋白 ，與單糖影響 Vir區(qū)的表達(dá)有關(guān) 。 Ros基因與 Vir基因的負(fù)調(diào)節(jié)有關(guān) 。 可見(jiàn) ， 目前已知農(nóng)桿菌染色體上有 10個(gè)基因與 TDNA轉(zhuǎn)移有關(guān) 。 第四節(jié) 農(nóng)桿菌 Ti質(zhì)粒的改造及載體構(gòu)建 一 、 Ti質(zhì)粒的改造及卸甲載體構(gòu)建 二 、 中間載體的構(gòu)建 三 、 中間表達(dá)載體的構(gòu)建 四 、 植物基因轉(zhuǎn)化載體系統(tǒng)的構(gòu)建 一、 Ti質(zhì)粒的改造及卸甲載體構(gòu)建 野生型 Ti質(zhì)粒直接作為植物基因工程載體，存在如下障礙： ① Ti質(zhì)粒分子量過(guò)大，一般在 160～ 240kb，比pBR322質(zhì)粒大 50倍左右，在基因工程中難以操作；②大型的野生 Ti質(zhì)粒上分布著各種限制酶的多個(gè)切點(diǎn)，不論用何種限制酶切割，都會(huì)被切成很多片段，因此難以找到可利用的單一限制性?xún)?nèi)切酶位點(diǎn)，不能通過(guò)體外 DNA重組技術(shù)直接向野生型 Ti質(zhì)粒導(dǎo)入外源基因；③ TDNA區(qū)內(nèi)含有許多編碼基因，其中 Onc基因的產(chǎn)物干擾宿主植物中內(nèi)源激素的平衡，轉(zhuǎn)化細(xì)胞長(zhǎng)成腫瘤，阻礙細(xì)胞的分化和植株的再生；④ Ti質(zhì)粒不能在大腸桿菌中復(fù)制 , 即使得到重組質(zhì)粒，也只能在農(nóng)桿菌中進(jìn)行擴(kuò)增；而農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化率極低（ 10％左右） ,因此，通過(guò) Ti質(zhì)粒的體外操作，在常規(guī)分子克隆條件下幾乎不能構(gòu)建在 TDNA中只有單一切點(diǎn)的載體；⑤ Ti質(zhì)粒上還存在一些對(duì)于 TDNA轉(zhuǎn)移不起任何作用的基因。 為了使 Ti質(zhì)粒成為有效的外源基因?qū)胼d體 ， 必須 對(duì)野生型 Ti質(zhì)粒進(jìn)行一番科學(xué)的改造 。 十分幸運(yùn)的是 ， 大腸桿菌具有能與農(nóng)桿菌高效地接合轉(zhuǎn)移的特性 。 因此 ， 科學(xué)家們可以先將 TDNA片段克隆到大腸桿菌的質(zhì)粒中 ， 并插入外源基因 ， 最后通過(guò)接合轉(zhuǎn)移把外源基因引入到農(nóng)桿茵的 Ti質(zhì)粒上 ， 這是一種把預(yù)先進(jìn)行亞克隆 、 切除 、 插入或置換的 TDNA引入 Ti質(zhì)粒的有效方法 。 帶有重組 TDNA的大腸桿菌質(zhì)粒衍生載體稱(chēng)為 ” 中間載體 ” （ intermediate vector） ， 而接受中間載體的 Ti 質(zhì)粒則稱(chēng)為受體 Ti 質(zhì)粒 （ acceptor Ti p1asmid ） ， 一般是卸甲載體 （ disarmed vector） 。 1． Onc卸甲載體 所謂卸甲載體就是無(wú)毒的（ nononcogenic） Ti質(zhì)粒載體。因?yàn)槔靡吧偷?Ti質(zhì)粒作載體時(shí)，影響植株再生的直接原因是 TDNA中 Onc基因的致瘤作用。因此，為了使野生型的 Ti質(zhì)粒成為基因轉(zhuǎn)化的載體，必須切除 TDNA上的 Onc基因，即“解除”其“ 武裝 ” ,構(gòu)建成所謂“卸甲”或稱(chēng)“繳械”載體（ disarmed vector）。在這種Onc載體中，已經(jīng)缺失的 TDNA部位被大腸桿菌的一種常用的質(zhì)粒 pBR322取代。這樣任何適合于克隆在 pBR322質(zhì)粒中的外源 DNA片段，都可以通過(guò)與 pBR322質(zhì)粒 DNA的同源重組，而被共整合到 OncTi質(zhì)粒載體上。 2. Onc十 卸甲載體 對(duì)于研究外源基因在轉(zhuǎn)基因植株中的表達(dá) ，以及對(duì)于以改良農(nóng)作物為目的的植物基因工程而言 ， Onc一 體系是最有用的 。 不過(guò) ， 人們可能還要設(shè)計(jì)一些特殊的實(shí)驗(yàn)來(lái)研究外源基因在冠癭瘤組織中的表達(dá)問(wèn)題 。 在這種情況下 ， 使用 Onc十 菌株載體則比較合適 。 由于冠癭瘤組織具有不依賴(lài)于激素的表型特征 ， 所以這種載體系統(tǒng)的優(yōu)點(diǎn)在于它可以快速地增生冠癭組織 ， 比較快速而容易得到轉(zhuǎn)化體 。 二、中間載體的構(gòu)建 1. 中間載體的基本結(jié)構(gòu)與特點(diǎn) 為解決 Ti質(zhì)粒不能直接導(dǎo)入目的基因的困難 ， 構(gòu)建中間載體 （ intermediate vector ） 是有效方法之一 。 中間載體是一種在一個(gè)普通大腸桿菌的克隆載體 （ 例如 pBR322質(zhì)粒 ） 中插入了一段合適的