【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 不同的重組噬菌體 DNA經(jīng)過裂解生長(zhǎng)過程最終形成大量的噬菌斑。這些噬菌斑的集合，就構(gòu)成了基因文庫(kù)。而質(zhì)粒載體構(gòu)建的文庫(kù)是以菌落的形式存在的。 DNA及其重組分子的分離純化將大腸桿菌在含有麥芽糖的培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期； 加入 λ 噬菌體或重組 λ 噬菌體的懸浮液， 37℃ 培養(yǎng) 1小時(shí)； 用新鮮培養(yǎng)基稀釋，繼續(xù)培養(yǎng) 412小時(shí)。密度已達(dá) 10131014/L，大腸桿菌細(xì)胞已完全裂解； 超速離心，沉淀噬菌體； 苯酚抽提，釋放 λ DNA；乙醇或異丙醇沉淀 λ DNA。 DNA作為載體的優(yōu)點(diǎn)λ DNA可在體外包裝成噬菌體顆粒，能高效轉(zhuǎn)染大腸桿菌；λ DNA載體的裝載能力為 25kb，遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于質(zhì)粒的裝載量；重組 λ DNA分子的篩選較為方便；重組 λ DNA分子的提取較為簡(jiǎn)便；λ DNA載體的適合克隆和擴(kuò)增外源 DNA片段，但不適合表達(dá)。2700個(gè)外殼蛋白分子(四 )大腸桿菌的 M13單鏈?zhǔn)删w DNA 生物結(jié)構(gòu)M13噬菌體的外型呈絲狀 ；M13噬菌體由外殼包裝蛋白和正鏈 DNA組成 ；M13噬菌體不裂解宿主細(xì)胞，但抑制其生長(zhǎng) ；M13 DNA全長(zhǎng) 6407個(gè)核苷酸 ；M13 DNA上至少有 10個(gè)基因 。+DNA(+)DNARFDNARFDNAIIV 感染周期DNAIII VI I IV II X V VII IX VIIIIII VI I IV II X V VII IX VIIIlacZ‘polylinker 構(gòu)建野生型 M13RFDNAM13mpn系列載體 特點(diǎn)使克隆的 DNA片段以特定單鏈的形式輸出受體細(xì)胞外 ,這在 DNA定向突變中非常有用；M13重組分子篩選簡(jiǎn)便 ， 被 M13噬菌體感染的受體細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢，形成混濁斑，易于辨認(rèn)挑選。而且重組分子越大，混濁斑的混濁度亦越大 ；但 M13DNA載體的最大缺陷是裝載量小，只 有 ；III基因間區(qū)段(507bp)(五 )考斯質(zhì)粒 和噬菌粒vλ DNA載體和 M13DNA載體的裝載量最大分別為 25kb和 ，但在很多情況下，往往需要克隆更大的外源DNA片段，考斯質(zhì)粒和噬菌粒載體的構(gòu)建就是為了進(jìn)一步提高噬菌體 DNA的裝載量。v在包裝上限固定的條件下，大幅度縮短噬菌體 DNA的長(zhǎng)度，就能同步增加載體的裝載能力。v將噬菌體 DNA與包裝有關(guān)的序列 和 質(zhì)粒組裝在一起， 既能最大限度地縮短載體的長(zhǎng)度，同時(shí)又能保證重組 DNA分子在體外仍被包裝成有感染力的顆粒，這便是構(gòu)建考斯質(zhì)粒和噬菌粒載體的思路。pHC796400 bpTcrλfragmentcosoriApr PstIBamHISalI (cosmid)載體的構(gòu)建v考斯質(zhì)粒 是一類人工構(gòu)建的含有 λ DNAcos序列和質(zhì)粒復(fù)制子的特殊類型的載體 ；v裝載范圍為 3145kb。v1978年 Collins和 Hohn發(fā)明構(gòu)建 λ DNA片段 +pBR322片段 ； 的特點(diǎn)能像 λ DNA那樣進(jìn)行體外包裝 ,并高效轉(zhuǎn)染受體細(xì)胞； 能像質(zhì)粒那樣在受體細(xì)胞中自主復(fù)制；重組操作簡(jiǎn)便 ,篩選容易；裝載量大（ 45kb）且克隆片段具有一定的大小范圍；不能體內(nèi)包裝 ,不裂解受體細(xì)胞。 （ phagemid or phasmid）v噬菌粒 是一類人工構(gòu)建的含有單鏈?zhǔn)删w包裝序列、復(fù)制子 以及質(zhì)粒復(fù)制子、克隆位點(diǎn)、標(biāo)記基因的特殊類型的載體 。能像 M13DNA那樣體外包裝，并高效轉(zhuǎn)染受體細(xì)胞； 能像質(zhì)粒那樣在受體細(xì)胞中自主復(fù)制； 裝載量比常規(guī)的 M13mp系列要大很多 (10kb)； 通過克隆雙鏈 DNA能獲得同等長(zhǎng)度的單一單鏈 DNA； 重組操作簡(jiǎn)便，篩選容易。pUC118 pUC18 + M13間隔區(qū) IGpUC119 pUC19 + M13間隔區(qū) IG500 個(gè)拷貝MCSlacZ’lacIoriAprM13IGpUC118 / 119 3200 bp表示 M13輔助噬菌體 DNA重要的噬菌粒載體pUC118/pUC119噬菌粒載體的優(yōu)點(diǎn)：v具有小分子量的 cccDNA，可克隆高達(dá) 10kb的外源 DNA片 段，并易于進(jìn)行體外分離與操作；v編碼有一個(gè) Ampr基因作選擇標(biāo)記，便于轉(zhuǎn)化子的選擇；v拷貝數(shù)高，每個(gè)寄主細(xì)胞可高達(dá) 500個(gè)；v含有一個(gè)常用的多克隆位點(diǎn)，具有 ?互補(bǔ)；v具有質(zhì)粒與噬菌體的復(fù)制起始點(diǎn)；vpUC118與 pUC119的多克隆位點(diǎn)方向彼此相反，可用它 們制備克隆基因的正或負(fù)鏈 DNA；v可直接對(duì)克隆的 DNA進(jìn)行測(cè)序分析。pBluescript ： 體外轉(zhuǎn)錄載體pBluescript = pUC + f1ori + PT3 + PT72958 bpMCSlacZ’PT7oriAprf1oripBluescript PT3噬菌體啟動(dòng)子 PT3和 PT7強(qiáng)化外源基因的轉(zhuǎn)錄； 提取出來的單鏈 DNA重組分子在噬菌體 RNA聚合酶的存在下，又可實(shí)現(xiàn)外源基因的體外轉(zhuǎn)錄ColE1oripBluescript phagemid的結(jié)構(gòu)特征：v源生于 pUC和 M13載體v在多克隆位點(diǎn)兩側(cè)存在一對(duì) T3和 T7噬菌體的啟動(dòng)子，用以定向的指導(dǎo)外源 DNA或基因的轉(zhuǎn)錄；v同時(shí)具有一個(gè)單鏈?zhǔn)删w M13或 f1的復(fù)制起點(diǎn)和一個(gè)來自 ColE1質(zhì)粒的復(fù)制起點(diǎn)，可按不同的復(fù)制形式合成出單鏈或雙鏈 DNA；v含有一個(gè) Ampr基因作選擇標(biāo)記，便于轉(zhuǎn)化子的選擇；v拷貝數(shù)高， 每個(gè)寄主細(xì)胞可高達(dá) 500個(gè)；v含有一個(gè)常用的多克隆位點(diǎn)，具有 ?互補(bǔ)；v可直鏈對(duì)克隆的 DNA進(jìn)行測(cè)序分析。（六） 人造染色體載體v人類、動(dòng)物、植物的全基因組序列分析往往需要克隆數(shù)百甚至上千 kb的 DNA片段 ,此時(shí)考斯質(zhì)粒和噬菌粒載體的裝載 量也遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足需要。v將細(xì)菌接合因子或酵母菌染色體上的復(fù)制區(qū)、分配區(qū)、穩(wěn) 定區(qū)與質(zhì)粒組裝在一起 ,即可構(gòu)成染色體載體。當(dāng)大片段的外源 DNA克隆在這些染色體載體上后 ,便形成重組人造染色體。v它能像天然染色體那樣，在受體細(xì)胞中穩(wěn)定的復(fù)制并遺傳。（ Bacterial Artificial Chromosomes BAC）v細(xì)菌人造染色體通常是在大腸桿菌性因子 F質(zhì)粒的基礎(chǔ)上 構(gòu)建的，其裝載量范圍在 50300kb之間 ；v各種類型的 pBACs在大腸桿菌受體菌只能維持單一拷貝 ；vpBACs主要適用于：克隆大型基因簇 (gene cluster)結(jié)構(gòu) ；構(gòu)建動(dòng)植物基因文庫(kù) 。URA3EcoRIpYAC4CEN4TELBamHITELoriAprTRP1ARS1 （ Yeast Artificial Chromosomes YAC）YAC載體應(yīng)含有下列元件： 170。酵母染色體的端粒序列 ；170。酵母染色體的復(fù)制子 ；170。酵母染色體的中心粒序列 ；170。酵母系統(tǒng)的選擇標(biāo)記 ；170。大腸桿菌的復(fù)制子 ；170。大腸桿菌的選擇標(biāo)記 ；170。YAC載體的裝載量為 350400kb。二、表達(dá)載體v在 研究中經(jīng)常需要獲得大量蛋白質(zhì)，以便深入開展下一步的工作 。v通過生物化學(xué)手段提取和純化蛋白是一件費(fèi)時(shí)費(fèi)力、而且效果欠佳的方法，甚至有時(shí)是不可能的。v在得到目的蛋白的編碼基因后，使基因進(jìn)行超量表達(dá)，能夠高效分離純化蛋白質(zhì)，這樣得到的蛋白質(zhì)產(chǎn)物既可以滿足精確的實(shí)驗(yàn)要求，也可以用于蛋白質(zhì)產(chǎn)品的生產(chǎn)。v作為表達(dá)載體首先必須滿足克隆載體的基本要求。即能將外源基因運(yùn)載到受體細(xì)胞中，其基本骨架是最簡(jiǎn)單的質(zhì)粒克隆載體中的 復(fù)制起點(diǎn) 和 抗生素抗性基因；v在基本骨架的基礎(chǔ)上，增加 表達(dá)元件， 就構(gòu)成來表達(dá)載體。（一）啟動(dòng)子 (Promoters) 170。啟動(dòng)子本身并不控制基因活動(dòng)，它就像 “ 開關(guān) ” 一樣，通過與 RNA聚合酶 及其他 蛋白輔助因子 等反式作用因子的相互作用 ,從而控制基因轉(zhuǎn)錄的起始時(shí)間和表達(dá)的程度。170。啟動(dòng)子 是 RNA聚合酶能夠識(shí)別并與之結(jié)合，從而起始基因轉(zhuǎn)錄的一段 DNA序列，通常位于基因上游；v啟動(dòng)子的篩選AprorigalKpKO1采用鳥槍法戰(zhàn)略，將合適大小的 DNA片段克隆到啟動(dòng)子探針質(zhì)粒 pKO1上；受體細(xì)胞染色體 DNA上的 galE、 galT與質(zhì)粒上報(bào)告基因 galk的表達(dá)產(chǎn)物聯(lián)合作用，可將培養(yǎng)基中的半乳糖酵解成紅色素物質(zhì)。轉(zhuǎn)化 galE+、 galT+、 galK的大腸桿菌受體菌株含有外源啟動(dòng)子活性的重組克隆v啟動(dòng)子最佳距離的探測(cè) 目的基因E EA啟動(dòng)子A 酶切開Bal31酶解目的基因E Ev啟動(dòng)子的構(gòu)建