【正文】 216。松弛型復(fù)制 ， 50 100拷貝 /cell；216。30多個單一位點(diǎn)；216。分子量 2686bp；216。正選擇顏色標(biāo)記 lacZ’；216。 216?？截悢?shù) 20233000/cell216。正選擇顏色標(biāo)記 lacZ’216。用于外源基因的高效表達(dá) 2743 bpMCSlacZ’ PT7oriAprpGEM3Z PSP66. 質(zhì)粒 DNA的分離與純化氯化銫密度梯度離心法 沸水浴法 216。質(zhì)粒 DNA純度底、快速、操作簡便216。用含有 EDTA的緩沖液懸浮菌體 170。加 CsCl和溴乙錠 170。在紫外燈下吸取 cccDNA170。在 pH值在 ，線性染色體 DNA片段會被變性，而閉合環(huán)狀的質(zhì)粒的 DNA則不會被變性或只有少量的氫鍵斷裂 。170。cccDNALDNA ocDNADDNA沸水浴法 170。加溶菌酶裂解細(xì)菌細(xì)胞壁 ； 170。離心，用無菌牙簽挑去沉淀物 ； 170。噬菌體或病毒 是一類非細(xì)胞微生物，能高效 率 、 高特異性地侵染宿主細(xì)胞，然后或自主 復(fù)制繁殖，或整合入宿主基因組中潛伏起來， 而且在一定的條件下上述兩種狀態(tài)還會相互 轉(zhuǎn)化。噬菌體或病毒的上述特性使得它們的 DNA能 被開發(fā)成為基因工程的有用載體，因?yàn)椋篎高效率的感染性能使外源基因高效導(dǎo)入受 體細(xì)胞 ；F自主復(fù)制繁殖性能使外源基因在受體細(xì)胞 中高效擴(kuò)增 ；170。λ 噬菌體生物學(xué)特性：感染周期吸附注入 復(fù)制包裝裂解170。λ 噬菌體生物學(xué)特性：溶原狀態(tài)216。整合主要由 λ DNA上的 cI和 int兩基因的產(chǎn)物所激活，而這兩個基因的開放與關(guān)閉又取決于宿主細(xì)胞本身的性質(zhì) ；216。DNA重組技術(shù)一般需要 λ 噬菌體進(jìn)入 溶菌狀態(tài) 。野生型 λDNA 包裝的上限為 51kb，本身長度為，只有當(dāng)插入的外源 DNA片段不大于 時，才能被包裝成有感染力的噬菌體顆粒。因此縮短野生型 λDNA 的長度，可以提高裝載量。170。具有 一個限制性內(nèi)切酶位點(diǎn) 。具有 成對的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)， 在兩個位 點(diǎn)之間的 DNA區(qū)段可以被外源 DNA片段取代。野生型的 λDNA 鏈上有 5個 EcoRI位點(diǎn)和 7個 HindIII位點(diǎn)，不 利于重組操作，必須刪除至 12個 ；216。除了簡單的切割外 ，還需要采用定點(diǎn)突變技術(shù)去除或增添酶 切 位點(diǎn)。與質(zhì)粒不同，野生型 λ DNA上缺少合適的選擇標(biāo)記，因此 ,加裝選擇標(biāo)記是 λ DNA克隆載體構(gòu)建的重要內(nèi)容；216。imm434基因編碼一種阻止 λ 噬菌體進(jìn)入 溶菌 循環(huán) 的阻遏物；216。當(dāng)外源 DNA插入到標(biāo)記基因中，基因 失活， λ 重組分子便進(jìn)入溶菌循環(huán)， 形成透明斑；加裝選擇標(biāo)記 lacZ216。當(dāng)外源基因插入到 lacZ基因中， 基因失活，不能合成藍(lán)色化合物；216。Spi正選擇型載體170。170。構(gòu)建琥珀密碼子的突變體 216。216。216。 DNA重組分子的體外包裝v外源 DNA插入到 ?噬菌體載體后，需將重組 DNA分子導(dǎo)入宿主細(xì)胞中。vλ DNA重組分子需在體外人工包裝成有感染力的噬菌體重組顆粒，方可高效導(dǎo)入受體細(xì)胞；v用于體外包裝的蛋白質(zhì)可直接從感染了 λ 噬菌體的大腸桿菌中提取，現(xiàn)已商品化。包裝時，當(dāng)且僅當(dāng)這兩部分包裝蛋白與重組 λ DNA分子混合后，包裝才能有效進(jìn)行。?噬菌體頭部外殼蛋白質(zhì)容納 DNA的能力是有一定限度的，控制在野生型 ?DNA長度的 75%105%之間。170。λ 噬菌體載體屬于 克隆載體， 主要用于克隆 DNA片段。 λ 噬菌體進(jìn)行克隆在 構(gòu)建基因文庫 時，不同的重組噬菌體 DNA經(jīng)過裂解生長過程最終形成大量的噬菌斑。而質(zhì)粒載體構(gòu)建的文庫是以菌落的形式存在的。密度已達(dá) 10131014/L，大腸桿菌細(xì)胞已完全裂解； 超速離心，沉淀噬菌體； 苯酚抽提，釋放 λ DNA；乙醇或異丙醇沉淀 λ DNA。2700個外殼蛋白分子(四 )大腸桿菌的 M13單鏈?zhǔn)删w DNA 生物結(jié)構(gòu)M13噬菌體的外型呈絲狀 ；M13噬菌體由外殼包裝蛋白和正鏈 DNA組成 ；M13噬菌體不裂解宿主細(xì)胞，但抑制其生長 ；M13 DNA全長 6407個核苷酸 ；M13 DNA上至少有 10個基因 。而且重組分子越大，混濁斑的混濁度亦越大 ；但 M13DNA載體的最大缺陷是裝載量小，只 有 ；III基因間區(qū)段(507bp)(五 )考斯質(zhì)粒 和噬菌粒vλ DNA載體和 M13DNA載體的裝載量最大分別為 25kb和 ，但在很多情況下，往往需要克隆更大的外源DNA片段，考斯質(zhì)粒和噬菌粒載體的構(gòu)建就是為了進(jìn)一步提高噬菌體 DNA的裝載量。v將噬菌體 DNA與包裝有關(guān)的序列 和 質(zhì)粒組裝在一起， 既能最大限度地縮短載體的長度，同時又能保證重組 DNA分子在體外仍被包裝成有感染力的顆粒，這便是構(gòu)建考斯質(zhì)粒和噬菌粒載體的思路。v1978年 Collins和 Hohn發(fā)明構(gòu)建 λ DNA片段 +pBR322片段 ； 的特點(diǎn)能像 λ DNA那樣進(jìn)行體外包裝 ,并高效轉(zhuǎn)染受體細(xì)胞； 能像質(zhì)粒那樣在受體細(xì)胞中自主復(fù)制；重組操作簡便 ,篩選容易；裝載量大（ 45kb）且克隆片段具有一定的大小范圍；不能體內(nèi)包裝 ,不裂解受體細(xì)胞。能像 M13DNA那樣體外包裝，并高效轉(zhuǎn)染受體細(xì)胞； 能像質(zhì)粒那樣在受體細(xì)胞中自主復(fù)制； 裝載量比常規(guī)的 M13mp系列要大很多 (10kb)； 通過克隆雙鏈 DNA能獲得同等長度的單一單鏈 DNA； 重組操作簡便，篩選容易。pBluescript ： 體外轉(zhuǎn)錄載體pBluescript = pUC + f1ori + PT3 + PT72958 bpMCSlacZ’PT7oriAprf1oripBluescript PT3噬菌體啟動子 PT3和 PT7強(qiáng)化外源基因的轉(zhuǎn)錄； 提取出來的單鏈 DNA重組分子在噬菌體 RNA聚合酶的存在下，又可實(shí)現(xiàn)外源基因的體外轉(zhuǎn)錄ColE1oripBluescript phagemid的結(jié)構(gòu)特征：v源生于 pUC和 M13載體v在多克隆位點(diǎn)兩側(cè)存在一對 T3和 T7噬菌體的啟動子，用以定向的指導(dǎo)外源 DNA或基因的轉(zhuǎn)錄；v同時具有一個單鏈?zhǔn)删w M13或 f1的復(fù)制起點(diǎn)和一個來自 ColE1質(zhì)粒的復(fù)制起點(diǎn)，可按不同的復(fù)制形式合成出單鏈或雙鏈 DNA；v含有一個 Ampr基因作選擇標(biāo)記，便于轉(zhuǎn)化子的選擇；v拷貝數(shù)高， 每個寄主細(xì)胞可高達(dá) 500個；v含有一個常用的多克隆位點(diǎn)，具有 ?互補(bǔ)；v可直鏈對克隆的 DNA進(jìn)行測序分析。v將細(xì)菌接合因子或酵母菌染色體上的復(fù)制區(qū)、分配區(qū)、穩(wěn) 定區(qū)與質(zhì)粒組裝在一起 ,即可構(gòu)成染色體載體。v它能像天然染色體那樣，在受體細(xì)胞中穩(wěn)定的復(fù)制并遺傳。URA3EcoRIpYAC4CEN4TELBamHITELoriAprTRP1ARS1 （ Yeast Artificial Chromosomes YAC）YAC載體應(yīng)含有下列元件： 170。酵母染色體的復(fù)制子 ；170。酵母系統(tǒng)的選擇標(biāo)記 ；170。大腸桿菌的選擇標(biāo)記 ；170。二、表達(dá)載體v在 研究中經(jīng)常需要獲得大量蛋白質(zhì)，以便深入開展下一步的工作 。v在得到目的蛋白的編碼基因后，使基因進(jìn)行超量表達(dá)，能夠高效分離純化蛋白質(zhì)，這樣得到的蛋白質(zhì)產(chǎn)物既可以滿足精確的實(shí)驗(yàn)要求，也可以用于蛋白質(zhì)產(chǎn)品的生產(chǎn)。即能將外源基因運(yùn)載到受體細(xì)胞中，其基本骨架是最簡單的質(zhì)?？寺≥d體中的 復(fù)制起點(diǎn) 和 抗生素抗性基因；v在基本骨架的基礎(chǔ)上，增加 表達(dá)元件， 就構(gòu)成來表達(dá)載體。啟動子本身并不控制基因活動，它就像 “ 開關(guān) ” 一樣，通過與 RNA聚合酶 及其他 蛋白輔助因子 等反式作用因子的相互作用 ,從而控制基因轉(zhuǎn)錄的起始時間和表達(dá)的程度。啟動子 是 RNA聚合酶能夠識別并與之結(jié)合，從而起始基因轉(zhuǎn)錄的一段 DNA序列，通常位于基因上游；v啟動子的篩選AprorigalKpKO1采用鳥槍法戰(zhàn)略，將合適大小的 DNA片段克隆到啟動子探針質(zhì)粒 pKO1上；受體細(xì)胞染色體 DNA上的 galE、 galT與質(zhì)粒上報告基因 galk的表達(dá)產(chǎn)物聯(lián)合作用，可將培養(yǎng)基中的半乳糖酵解成紅色素物質(zhì)。野生型的 Plac與其控制區(qū) Olac偶聯(lián)在一起，在沒有誘導(dǎo)物存在時，整個操縱子處于基底水平表達(dá)；基底水平轉(zhuǎn)錄170。Plac O高效轉(zhuǎn)錄葡萄糖代謝170。 基底水平轉(zhuǎn)錄170。因此，基因工程中使用的乳糖啟動子均為抗葡萄糖代謝阻遏的突變型，即 Plac UV5。