基因工程載體-噬菌體載體-在線瀏覽
2024-10-22 21:10本頁(yè)面
【正文】 ’GCCCCGCCGCTGGA The phage ? cos ends Circular form Linear form （二） λ噬菌體載體的主要類型 （ 1） 插入式載體 一種只具有一個(gè)可供外源 DNA插入的克隆位點(diǎn)的 派生載體。 （ 3） 凱倫噬菌體載體 （ 2） λ 替換型載體（取代型載體） ? 外源 DNA取代噬菌體染色體中對(duì)于噬菌體的感染和復(fù)制非必要的片段 (~ 20 kb) ? 高感染效率 (109 轉(zhuǎn)化株 /ug 載體 DNA, 比質(zhì)粒高 100倍 ) . EMBL3, ?DASH 替換式載體 野生型噬菌體染色體的中段對(duì)于噬菌體的感染和復(fù)制是非必要的 ， 外源 DNA可以取代這一片段 ， 例如Charon 4A、 λEMBL 3/ Charon40等載體 ， 這些載體是用 Lac 5（ 乳糖操縱子的大部分系列 ， 包括完整的 Lac Z） 替換入噬菌體的中間區(qū)段 ， 同時(shí)將 Lac 5作為選擇標(biāo)記 ， 使用時(shí)用 EcoRI水解 ， 去掉中間的片段 ，再與欲克隆片段在體外進(jìn)行重組 、 包裝 。 換型噬菌體 λ 是使用最廣泛的載體 。這是因?yàn)橐愿腥痉绞綄?dǎo)入細(xì)胞的頻率可達(dá)106~108/μgDNA ，而以轉(zhuǎn)染（ translation）的方式導(dǎo)入的頻率僅為 103~105/ μgDNA 。 由于 λ 噬菌體包裝時(shí)，當(dāng) DNA的長(zhǎng)度短于野生型的 78%或超過 105%時(shí)，噬菌體的活性就急劇下降。 插入式載體可攜帶的外源ＤＮＡ片段較替換式為小。 篩選標(biāo)記： 藍(lán)白斑 (LacZ)、 噬菌斑 等。 用途： cDNA文庫(kù)。 。 優(yōu)越性： 1. 單鏈 DNA噬菌體的復(fù)制，是以雙鏈環(huán)形的 DNA為媒介的，這種復(fù)制形式 的 DNA簡(jiǎn)稱 RFDNA； 2. 不論是 RFDNA還是 ssDNA都能感染大腸桿菌； 3. 單鏈 DNA噬菌體顆粒的大小，是受其 DNA的多制約的，不存在包裝限制 問題； 4. 容易測(cè)定外源 DNA片斷的插入取向； 5. 可產(chǎn)生含外源片斷的單鏈 DNA分子。 2. M13噬菌體能以 單鏈 和 雙鏈 兩種方式存在，因此可以用 感染 (經(jīng)包裝的單鏈 DNA)和 轉(zhuǎn)化 (雙鏈 DNA)。 M13噬菌體載體 M13是一種含單鍵（ +） DNA（ ssDNA）的絲狀大腸桿菌噬菌體，其基因組大小為 。 M13噬菌體的特點(diǎn) ?感染 Ecoli后，在宿主細(xì)胞內(nèi)會(huì)形成雙鏈的復(fù)制型ＤＮＡ（ replication form DNA, RF DNA）。 ?成熟的噬菌體顆粒僅能感染 F+細(xì)胞，這是因?yàn)檫@種噬菌體的感染位點(diǎn)在性散毛上。 ?噬菌體顆粒的大小是受其ＤＮＡ的大小制約的，這一點(diǎn)正好與 λ 噬菌體相反。 M13單鏈DNA噬菌體的生命周期 RF DNA Phage M13 replication in the host cell: + RNA pol DNA polIII 177。 在 IG區(qū)內(nèi)插入一個(gè)大腸桿菌的 LacZ’（ ?肽序列 )。 (2)加入酶切位點(diǎn) ① 在 IG區(qū)內(nèi)加入單一內(nèi)切酶位點(diǎn) 第一個(gè) M13載體： M13mp1： M13 RF BsuI不完全消化 各種長(zhǎng)度的線性片斷 （其中應(yīng)有只在IG上切開的線性全長(zhǎng) M13） lac基因的HindII片斷 (lacI、lacP、 lacO、 lacZ’） 連接 M13mp1 JM101宿主 只有在 IG區(qū)插入 lacZ’才能存活并在 Xgal上出現(xiàn)互補(bǔ)的藍(lán)噬菌斑 （三） M13系列載體的優(yōu)點(diǎn) 1） 有 MCS，便于克隆不同的酶切片段 2） Xgal顯色反應(yīng)，可供直接選擇 3）無包裝限制，克隆能力大 4）可以克隆雙鏈 DNA分子中的每一條鏈 子代 M13噬菌體中包含的是單鏈 +DNA。 M13載體 ? 具有多克隆位點(diǎn) (MCS)，方便克隆。 ? 可以定向地克隆 DNA片段 ， 克隆在 M13 RF DNA分子上的雙鏈 DNA片段 ， 到了子代噬菌體便成了單鏈的形式 。 根據(jù) M13的生物學(xué)特性知道 ，M13子代噬菌體中總是只含有 （ ＋ ） 鏈 ， 所以 M13載體克隆的外源
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