【正文】 lacZ基因，可用 XgalIPTG組織顯色反應(yīng)法篩選噬菌粒載體。 利用 ?肽序列中的三個(gè)單一酶切位點(diǎn)（ Bgl II、 Ava II 和 Pvu I）。 （四） λDNA的抽提 1)大腸桿菌培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期 2) 加入 λ噬菌體或重組 λ噬菌體懸浮液， 37℃培養(yǎng) 1hr 3) 用新鮮培養(yǎng)稀釋，繼續(xù)培養(yǎng) 412hr 4) 高速離心，沉淀噬菌體 5) 苯酚抽提，釋放 λDNA 6) 乙醇或異丙醇沉淀 DNA （五） λDNA作為載體的優(yōu)點(diǎn) 1) 體外包裝病毒顆粒，高效感染 2) 裝載外源能力為 25kb，大于質(zhì)粒 3) 篩選方便 4) 重組 λDNA分子提取容易 二、 單鏈?zhǔn)删w載體 （一） 單鏈?zhǔn)删w載體 M1 f fd 噬菌體 單鏈環(huán)狀 DNA的絲狀大腸桿菌噬菌體： M13 噬菌體 單鏈 DNA噬菌體載體 M1 f fd。 （ 2） 替換型載體（取代型載體） 具有成對(duì)的克隆位點(diǎn)，在這 兩個(gè)位點(diǎn)之間的 λDNA區(qū)段可以被外源插入的 DNA片段所取代。 T4 Bacteriophage 7 1. 噬菌體的生物學(xué)特性 溶菌周期指噬菌體將 DNA注入寄主細(xì)胞后很快環(huán)化，然后進(jìn)行自我復(fù)制、蛋白衣殼合成和新噬菌體顆粒的組裝，最后使寄主細(xì)胞破裂而釋放出大量的子代噬菌體。 換型噬菌體 λ 是使用最廣泛的載體 。 2. M13噬菌體能以 單鏈 和 雙鏈 兩種方式存在，因此可以用 感染 (經(jīng)包裝的單鏈 DNA)和 轉(zhuǎn)化 (雙鏈 DNA)。 M13載體 ? 具有多克隆位點(diǎn) (MCS)，方便克隆。 MCS的中部已經(jīng)切開，各有一個(gè) 3’端突出的 T。凡具有 cos位點(diǎn)的任何DNA分子只要在長(zhǎng)度相當(dāng)于噬菌體基因組，就可以同外殼蛋白結(jié)合而被包裝成類似噬菌體 λ 的顆粒。 cosmid載體帶有質(zhì)粒的復(fù)制起點(diǎn)、克隆位點(diǎn)、選擇性標(biāo)記以及 λ 噬菌體用于包裝的cos末端等，因此該載體在體外重組后，可利用噬菌體體外包裝的特性進(jìn)行體外包裝，利用噬菌體感染的方式將重組 DNA導(dǎo)入受體細(xì)胞。 常用的噬菌粒載體 pUC118和 pUC119 1. 具有較小分子量的共價(jià)、閉合、環(huán)形的基因組 DNA，可克隆 10kb的外源 DNA片段，并易于進(jìn)行分離與操作； 2. 編碼一個(gè) ampr基因作為選擇記號(hào)，因此只有攜帶pUC118或 pUC119噬菌粒載體的大腸桿菌轉(zhuǎn)化子細(xì)胞，才能夠在含有氨芐青霉素的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，便于轉(zhuǎn)化子的選擇； 3. 拷貝數(shù)含量高，每個(gè)寄主可高達(dá) 500個(gè)，所以只要用少量的大腸桿菌細(xì)胞培養(yǎng)物，便可制備出大量的載體DNA； 4. 存在著一個(gè)多克隆位點(diǎn)區(qū)，因此許多種不同類型的外源 DNA片段，不經(jīng)修飾便可直接插入到載體分子上； 5. 由于多克隆位點(diǎn)區(qū)阻斷了大腸桿菌 lacZ基因的5’端編碼區(qū)，可按照 IPTG組織化學(xué)顯色反應(yīng)試驗(yàn)，篩選重組子； 6. lacZ基因是置于 lac啟動(dòng)子的控制之下，這樣插入的外源基因便會(huì)以融合蛋白質(zhì)的形式表達(dá)； 7. 含有質(zhì)粒的復(fù)制起點(diǎn)，在沒有輔助噬菌體的情況下，克隆的外源基因可以像質(zhì)粒一樣按常規(guī)的方式，復(fù)制形成大量的雙鏈 DNA分子 8. 帶有一個(gè) M13噬菌體的復(fù)制起點(diǎn)，在有輔助噬菌體感染的寄主細(xì)胞中，可以合成出單 DNA拷貝，并包裝成噬菌體顆分泌到培養(yǎng)基中； 9. 在 pUC118和 pUC119這兩個(gè)載體中，多克隆位點(diǎn)區(qū)的核苷酸序列取向是彼此相反的，于是它們當(dāng)中的一個(gè)可轉(zhuǎn)錄克隆基因的正鏈 DNA，另一個(gè)則可轉(zhuǎn)錄出負(fù)鏈 DNA； 10. 可以直接對(duì)克隆的 DNA片斷進(jìn)行核苷酸的序列測(cè)定，免去了從質(zhì)粒載體到噬菌體的這一煩瑣的亞克隆步驟。 在 IG區(qū)內(nèi)插入一個(gè)大腸桿菌的 LacZ’（ ?肽序列 )。 。 λ噬菌體的基因組結(jié)構(gòu) 5‘CGGGGCGGCGACCTCG3’ 3’GCCCCGCCGCTGGAGC5’ Cleavage Ligation (during packaging) (after infection) GGGCGGGCGACCTCG3’ 5’CG