基因工程載體-噬菌體載體-文庫吧資料
2024-09-24 21:10本頁面
【正文】 利用 ?肽序列中的三個單一酶切位點（ Bgl II、 Ava II 和 Pvu I）。 RF Nicked by gene 2 protein + ssRolling circle replication, then cut and ligate Coated with gene 5 protein Gene 5 protein is replaced by gene 8 protein ect. Linear M13 phagereleased from the cell. （二） M13載體的構(gòu)建 （ 1）克隆區(qū)域的選定 ① 基因間隔區(qū)（ intergenic region, IG區(qū)） J. Messing證明， IG區(qū)存在M13的復(fù)制起點，但可以插入外源 DNA而不影響 M13噬菌體的活力。所以 M13噬菌體并不存在包裝限制的問題。但是無論是 RF DNA或 ss DNA都能轉(zhuǎn)染 F+或 F細(xì)胞?？梢韵筚|(zhì)粒ＤＮＡ那樣在體外進(jìn)行純化和操作。這類載體主要用來獲得大量的單鏈ＤＮＡ片段，這種單鏈ＤＮＡ片段在遺傳學(xué)研究中主要用來測定ＤＮＡ序列（ sanger雙脫氧法）、基因的定點突變研究、異源雙鏈 DNA的分析等。 3. 克隆的外源基因片段不宜大于 1000bp。 3. M13噬菌體 噬菌體 正鏈 復(fù)制 復(fù)制型 DNA 經(jīng) pII蛋白 造缺口 3′ 5′ 經(jīng) pII 蛋白 剪切 釋出單鏈 DNA(正鏈 ) 進(jìn)入下 一循環(huán) 5′ 3′ 3′ 5′ 滾環(huán)復(fù)制 在細(xì)菌內(nèi)的復(fù)制模式圖 M13噬菌體幾個重要特點 ： 1. M13噬菌體 不溶解 宿主細(xì)胞，只是 降 低 宿主細(xì)胞的生長速度。 （四） λDNA的抽提 1)大腸桿菌培養(yǎng)至對數(shù)生長期 2) 加入 λ噬菌體或重組 λ噬菌體懸浮液， 37℃培養(yǎng) 1hr 3) 用新鮮培養(yǎng)稀釋，繼續(xù)培養(yǎng) 412hr 4) 高速離心，沉淀噬菌體 5) 苯酚抽提，釋放 λDNA 6) 乙醇或異丙醇沉淀 DNA （五） λDNA作為載體的優(yōu)點 1) 體外包裝病毒顆粒，高效感染 2) 裝載外源能力為 25kb，大于質(zhì)粒 3) 篩選方便 4) 重組 λDNA分子提取容易 二、 單鏈?zhǔn)删w載體 （一） 單鏈?zhǔn)删w載體 M1 f fd 噬菌體 單鏈環(huán)狀 DNA的絲狀大腸桿菌噬菌體： M13 噬菌體 單鏈 DNA噬菌體載體 M1 f fd。 。 重組噬菌體 的分子量必須在 野生型噬 菌體 分子量大小的 75%至 105%之間。 ? ◆ λ噬菌體載體可接受 15 kb23 kb的外源DNA片段，它既可作為克隆載體，也可作為表達(dá)載體，廣泛用于各類基因庫的構(gòu)建。因此只包裝它的野生型DNA（ ）的 75%~105%左右的ＤＮＡ，要求 λ 載體 DNA和外源 DNA長度之和在 39～ 53kb之間。 λ 噬菌體的包裝限制為野生噬菌體 DNA（約 kb）的 75%~105%。 （ 3）凱倫噬菌體載體 既有插入型；又有替換型 在基因工程實驗中的用途十分廣泛 承受外源 DNA的能力：幾個 kb到 23kb （左右臂連接） （三段自身連接） （插入片段） （三）體外包裝 λ 噬菌體 DNA體外重組后，一般必須經(jīng)過體外包裝，然后以噬菌體感染的方式將重組 DNA導(dǎo)入 。 而后 ， 感染 ， 并裂解 ， 形成空斑 。 （ 2） 替換型載體（取代型載體） 具有成對的克隆位點，在這 兩個位點之間的 λDNA區(qū)段可以被外源插入的 DNA片段所取代。 ?噬菌體 A WB DEF Z J att xis N cl cro O P Q SR 結(jié)構(gòu)區(qū) 重組區(qū) 調(diào)控區(qū) 裂解區(qū) cos位點 cos 位點 A R A R EcoRI 目的基因 插入型 置換型 A W B C D E F Z U V G H M L K I J b2
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