基因工程載體質(zhì)粒-文庫吧資料
2024-08-28 21:16本頁面
【正文】 DNA)含 β半乳糖苷酶基因 (LacZ)的調(diào)控序列和該酶基因氨基端 146個氨基酸編碼信息 。若經(jīng)過環(huán)絲氨酸法多次重復處理 Tets 菌會富集，產(chǎn)量上可高出數(shù)倍，便于篩選重組子。所以在含有四環(huán)素培養(yǎng)基上，環(huán)絲氨酸只殺死 Tetr 細菌。 丟失四環(huán)素抗性標記的正選擇體系 四環(huán)素抗菌機理是抑制細菌蛋白質(zhì)合成，使細菌停止生長，但菌不死亡。帶有抗藥性質(zhì)粒稱為 R質(zhì)粒。新霉素（ Neo）等。 抗生素抗性基因選擇標記 ? 常用的是抗生素抗性基因的選擇標記。如PACYC184質(zhì)粒的 EcoRI上插入外源 DNA片段，會導致氯霉素抗生基因失活(Cms)。外源 DNA片段插入鈍化了一個抗性基因，保留了另一個抗性基因。帶有抗藥性質(zhì)粒稱為 R質(zhì)粒。 質(zhì)粒載體的選擇標記 最常用，主要有：四環(huán)素 (Tet)、氨芐青霉素 (Amp)、氯霉素 (Cm)、卡那霉素 (Kan)、新霉素 (Neo)等。 ? 質(zhì)粒載體的選擇標記： ? 外源 DNA片段與質(zhì)粒載體 DNA連接，再轉(zhuǎn)化入宿主菌，經(jīng)培養(yǎng)后需篩選鑒定轉(zhuǎn)化子。便于插入外源 DNA片段，易組建重組質(zhì)粒而不影響質(zhì)粒復制功能 ? 有多用途的輔助序列 ? 如加入不同啟動子序列，用于生產(chǎn)單鏈DNA或 RNA，外源基因的大量表達。一般約 2kb，含一個復制起始部位 Orgin（ Ori）拷貝數(shù) 多少 和攜帶有控制復制的基因信息。 5． 質(zhì)粒 DNA可插入 結(jié)合較大的外源 DNA 。 3． 質(zhì)粒應有較多的拷貝數(shù) 。 轉(zhuǎn)化入細菌的轉(zhuǎn)化率與質(zhì)粒大小呈反比 ， 當質(zhì)粒大于 15kb時 ， 轉(zhuǎn)化率將成為限制因素 ,質(zhì)粒大 ，拷貝數(shù)越低 。 在一定條件下 ， Hfr細胞又可重新變?yōu)?F+或 F細胞 。F因子可以通過接合作用自我轉(zhuǎn)移 ， 也能夠帶動寄主染色體一道轉(zhuǎn)移 。 ? F因子是雄性決定因子 ， F+細胞表面可以形成一種叫做性須 （ pilus） 的結(jié)果 ， 它促使F+經(jīng)性須進入 F細胞 。這種細胞稱之為 F細胞。這種細胞稱 F+細胞。 2） F 因子 F因子是最有代表性的接合型質(zhì)粒，又稱致育因子(fertility factor)或性質(zhì)粒 (Sex plasmid)。 這種由共存的接合型質(zhì)粒引發(fā)的非接合型質(zhì)粒的轉(zhuǎn)移過程 ， 叫質(zhì)粒的遷移作用 (mobilization)又叫質(zhì)粒的誘動 。 帶有大腸桿菌素基因的 Col質(zhì)粒和帶有抗菌素抗性基因的 R質(zhì)粒既有屬于接合型的 ， 也有屬于非接合型的 。 1）質(zhì)粒的類型 ? 非接合型質(zhì)粒的寄主細胞中同時存在一種接合型質(zhì)粒，那么它們通常也是可以被轉(zhuǎn)移的。 因為它們僅僅帶有自主復制的遺傳信息 。接合型質(zhì)粒多屬于嚴緊型質(zhì)粒 。 3. 質(zhì)粒的轉(zhuǎn)移性 革蘭氏陰性細菌的質(zhì)粒分為接合型質(zhì)粒 (Conjugative plasmid)， 又叫自我轉(zhuǎn)移質(zhì)粒 。在細菌增殖過程中，其中一種質(zhì)粒必然會丟失。 反之選用 松馳型 質(zhì)粒 。 ? PACYC184等質(zhì)粒屬嚴緊型質(zhì)粒 。 每個細胞中可達 50%以上 DNA是質(zhì)粒 DNA。 質(zhì)粒的復制不僅受自身的制約 ， 而且還受寄主菌的控制 。 嚴緊型質(zhì)粒 ， 一般分子量較高；每個寄主細胞中僅含 10~60個拷貝的質(zhì)粒； 松馳型質(zhì)粒 ,每個細菌中所含的質(zhì)粒 DNA的拷貝數(shù)高 ,一種質(zhì)粒究竟屬于嚴緊型還是松馳型并不是絕對的 。 質(zhì)粒的一般生物學性質(zhì) 1969年 Rownd提出嚴緊型復制控制的質(zhì)粒和松馳型控制的質(zhì)粒 。 ⑤ 隱蔽質(zhì)粒 (Cryptic plasmid)。 ③ 所有原核生物都有質(zhì)粒 。 質(zhì)粒載體 ? 質(zhì)粒 DNA的一般特點： ① 質(zhì)粒 DNA可在宿主菌中自主復制 ， 又是細菌復制非必須的 。質(zhì)粒是細菌復
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