基因工程載體質(zhì)粒(編輯修改稿)
2025-09-11 21:16 本頁(yè)面
【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 源 DNA 。 大腸桿菌質(zhì)粒分子的結(jié)構(gòu)示意圖 環(huán)形染色體 DNA 環(huán)形 質(zhì)粒分子 大腸桿菌細(xì)胞 抗菌素抗性基因 控制 質(zhì)粒 DNA轉(zhuǎn)移的基因 質(zhì)粒 DNA 質(zhì)粒主要包括幾個(gè)組成部分 ? 復(fù)制子（ reilcator） ? 復(fù)制起始位點(diǎn) (replication origin site) ? 多克隆位點(diǎn)（ Polylink） (MCS) ? 輔助序列 (COS位點(diǎn)等 ) ? 選擇標(biāo)記 (LacZ,抗性等 ) pUC 18 和 pUC 19質(zhì)粒圖譜 ? 質(zhì)粒主要包括幾個(gè)組成部分： ? 一 、 復(fù)制子 （ reilcator） ? 也就是基礎(chǔ)復(fù)制子（ basic replicon），具有原質(zhì)粒同樣拷貝數(shù)的最小自主復(fù)制單位。一般約 2kb，含一個(gè)復(fù)制起始部位 Orgin（ Ori）拷貝數(shù) 多少 和攜帶有控制復(fù)制的基因信息。 復(fù)制起始位點(diǎn) (replication origin site) 是富 含 A, T區(qū) ,雙鏈 DNA在此 解鏈出現(xiàn)復(fù)制叉 . 緊靠 富 A, T區(qū)的側(cè)面富 G,C區(qū) ,組成回文結(jié)構(gòu) ,是 參與復(fù)制相關(guān)因子識(shí)別和結(jié)合位點(diǎn) . ? 具備有多克隆位點(diǎn) （ Polylink ）(MCS) ? 有數(shù)種限制性內(nèi)切酶 單一識(shí)別位點(diǎn) 。便于插入外源 DNA片段，易組建重組質(zhì)粒而不影響質(zhì)粒復(fù)制功能 ? 有多用途的輔助序列 ? 如加入不同啟動(dòng)子序列，用于生產(chǎn)單鏈DNA或 RNA，外源基因的大量表達(dá)。又加入 COS位點(diǎn)，使載體能容納更大的DNA片段等等。 ? 質(zhì)粒載體的選擇標(biāo)記： ? 外源 DNA片段與質(zhì)粒載體 DNA連接，再轉(zhuǎn)化入宿主菌，經(jīng)培養(yǎng)后需篩選鑒定轉(zhuǎn)化子。這就需要利用質(zhì)粒載體的可選擇標(biāo)記。 質(zhì)粒載體的選擇標(biāo)記 最常用，主要有：四環(huán)素 (Tet)、氨芐青霉素 (Amp)、氯霉素 (Cm)、卡那霉素 (Kan)、新霉素 (Neo)等。如質(zhì)粒對(duì)氨芐青霉素有抗生時(shí)，則寫成Ampr，反之則寫成 Amps。帶有抗藥性質(zhì)粒稱為 R質(zhì)粒。一個(gè)質(zhì)粒載體通常有二種抗生素抗性基因，這樣篩選質(zhì)粒載體更可靠。外源 DNA片段插入鈍化了一個(gè)抗性基因，保留了另一個(gè)抗性基因。插入失活型載體，就是將外源 DNA片段插入到會(huì)導(dǎo)致選擇性基因 (Ampr， Tetr等 )失活的位點(diǎn)。如PACYC184質(zhì)粒的 EcoRI上插入外源 DNA片段，會(huì)導(dǎo)致氯霉素抗生基因失活(Cms)。也有例外，如 VillaKomaroff等 1978年發(fā)現(xiàn)鼠胰島素 cDNA片段插入 PstI切點(diǎn)，并未使 Ampr基因失活。 抗生素抗性基因選擇標(biāo)記 ? 常用的是抗生素抗性基因的選擇標(biāo)記。主要有：四環(huán)素（ Ter），氨芐青霉素（ Amp），氯霉素（ Cm），卡那霉素（ Km）。新霉素（ Neo）等。如質(zhì)粒對(duì)氨芐青霉素有抗生時(shí)，則寫成 AmPr，反之則寫成 AmPs。帶有抗藥性質(zhì)粒稱為 R質(zhì)粒。一個(gè)質(zhì)粒載體通常有二種抗生素抗性基因 ? 新的質(zhì)粒還帶有下列標(biāo)記基因 ， 使于篩選重組體： ? ① HA ? ② Luaferase ? ③ GFP ? ④ 便于檢測(cè)的多肽 原理是具有四環(huán)素抗性的細(xì)菌對(duì)親脂的螯合劑萎蔫酸(fusaric acid)極為敏感，因此，將外源性 DNA插入到質(zhì)粒載體的四環(huán)素抗性基因的酶切位點(diǎn)上，在含有萎蔫酸的培養(yǎng)基上篩選對(duì)四環(huán)素敏感的重組子，則是十分方便的方法。 丟失四環(huán)素抗性標(biāo)記的正選擇體系 四環(huán)素抗菌機(jī)理是抑制細(xì)菌蛋白質(zhì)合成，使細(xì)菌停止生長(zhǎng)，但菌不死亡。環(huán)絲氨酸是氨基酸的類似物，在細(xì)菌的生長(zhǎng)過(guò)程中，如加入環(huán)絲氨酸，則會(huì)參入到細(xì)菌新合成的蛋白質(zhì)多肽鏈，使細(xì)菌死亡。所以在含有四環(huán)素培養(yǎng)基上，環(huán)絲氨酸只殺死 Tetr 細(xì)菌。對(duì)停止生長(zhǎng)的 Tets 菌則無(wú)致死
環(huán)評(píng)公示相關(guān)推薦
鄂ICP備17016276號(hào)-1