【文章內(nèi)容簡介】 的一般生物特性 可脫離寄主細胞生存，但不能進行復制。 除了對寄主的依賴性，還具備其它的功能： 保護自己的核苷酸分子（ DNA、 RNA）免遭環(huán)境化學物質(zhì)的破壞； 將其核苷酸分子注入到被感染的細菌細胞； 將被感染的細菌細胞轉(zhuǎn)變成制造噬菌體的體系，從而長生出大量的子代噬菌體顆粒； 使感染的細菌細胞釋放出子代的噬菌體顆粒 87 噬菌體的結(jié)構(gòu)和其核酸類型 ： 結(jié)構(gòu)： 無尾部結(jié)構(gòu)的二十面體型、 具尾部結(jié)構(gòu)的二十面體型、 線狀體型 核酸類型：最常見的是雙鏈線性 DNA、 雙鏈環(huán)形 DNA、 單鏈環(huán)形 DNA、 單鏈線形 DNA、 單鏈 RNA。 88 分為兩種： 1. 溶菌周期： 二、噬菌體的生活周期 感染細菌后立即在菌體內(nèi)復制和合成蛋白質(zhì)外殼，重新組裝成噬菌體顆粒，并導致細菌細胞解體，釋放出大量子代噬菌體。 烈性噬菌體（ virulent phage) 89 90 91 2. 溶原周期： 感染細菌后，將自己的 DNA整合到細菌的染色體 DNA中。形成這一過程稱為溶源化（ lysogenization)。 整合到細菌染色體的 噬菌體 DNA稱為 原噬菌體 ，隨細菌的染色體復制而復制。 溫和噬菌體（ temperate phage) 原噬菌體（ prophage)： 92 溫和噬菌體：既能進入溶菌生命周期又能進入溶 源生命周期。 溶源性細菌：具有一種完整的噬菌體基因組的細菌 溶源化： 用溫和噬菌體感染細菌培養(yǎng)物使之形成溶 源 性細菌的過程 整合： 噬菌體的 DNA是被包容在寄主細胞染色體 DNA中 原噬菌體：在溶源細菌內(nèi)存在的整合的或非整合的 噬菌體 超感染免疫性：溶源性細菌不能夠被頭一次感染并 使 之溶源化的同種噬菌體再感染 93 94 溶源周期的主要特征： λ 噬菌體 特征 ： 噬菌體的 DNA分子注入細菌細胞 經(jīng)過短暫的轉(zhuǎn)錄之后，需要合成一種整合酶，于是轉(zhuǎn)錄活性便被一種阻遏物所關(guān)閉 噬菌體的 DNA分子插入到細菌染色體基因組 DNA上，變成原噬菌體 細菌繼續(xù)生長、 增殖， 噬菌體的基因作為細菌染色體的一部分進行復制。 95 三、單鏈噬菌體載體 iii) M1 f fd 噬菌體 單鏈環(huán)狀 DNA的絲狀大腸桿菌噬菌體： M13 噬菌體 96 （ 2）復制型（ RF）是雙鏈環(huán)狀 DNA。 1. 單鏈 DNA噬菌體的特點 （ 3） RF DNA和 ssDNA都能轉(zhuǎn)染感受態(tài) 大腸桿菌。并產(chǎn)生噬菌斑。 （ 5）可產(chǎn)生大量的含有外源 DNA插入片 斷的 單鏈分子 ，便于作探針或測序。 （ 1） +DNA。（ ssDNA） （ 4）不存在包裝限制。 97 2. M13 噬菌體 RF dsDNA在寄主細胞內(nèi)以高拷貝形式存在。 成熟的噬菌體里只包裝有 + DNA，也容易提取。 M13噬菌體只感染 雄性 大腸桿菌。 但 M13 DNA可以轉(zhuǎn)染雌性大腸桿菌。 6407 bp。 （ 2） DNA長度 （ 3） DNA提純 （ 1）寄主 98 99 （ 4） M13的生活周期 雖然不導致溶菌，但使菌斑混濁（細菌生長變慢，約為正常的 1/2—3/4） M13通過雄性細菌的 F性須 注入其 +DNA +DNA合成－ DNA，形成 RF dsDNA － DNA轉(zhuǎn)錄 mRNA、合成 +DNA、翻譯形成噬菌體蛋白 組裝成新的噬菌體 M13， 擠出寄主細胞 100 +DNA DNA mRNA M13外殼蛋白 組裝成子代 M13 +DNA 注入大腸桿菌 復制 轉(zhuǎn)錄 翻譯 +DNA 指導合成 +DNA 200個 RF DNA 每個細胞可以放出約 1000個 M13顆粒！ 101 3. M13載體的構(gòu)建： M13基因組中只有基因 II與基因 IV之間存在一段 507bp的基因間隔區(qū)。 （ 1）克隆區(qū)域的選定 ① 基因間隔區(qū)（ inter genic region, IG區(qū)） IG區(qū)內(nèi)只有一個 BsuI 切點。 其余 9個 BsuI限制性位點分布在其它部位。 ② 酶切位點 102 M13 J. Messing證明， IG區(qū)存在 M13的 復制起點 ，但可以插入外源 DNA而不影響 M13噬菌體的活力。 103 在 IG區(qū)內(nèi)插入一個大腸桿菌的 LacZ’（ ?肽序列 )。 利用 ?肽序列中的三個單一酶切位點（ Bgl II、 Ava II 和 Pvu I）。 （ 2）加入酶切位點 ① 在 IG區(qū)內(nèi)加入單一內(nèi)切酶位點 第一個 M13載體： M13mp1： 104 M13 RF BsuI不完全消化 各種長度的線性片斷 （其中應有只在IG上切開的線性全長 M13） lac基因的HindII片斷 (lacI、lacP、 lacO、 lacZ’） 連接 M13mp1 JM101宿主 只有在 IG區(qū)插入 lacZ’才能存活并在 Xgal上出現(xiàn)互補的藍噬菌斑 105 （ 3） M13載體系列 加上常用的酶切位點。 ① M13載體系列的命名 M13mpn n代表系列數(shù)字 ② 對 M13mp1的改進 B. Gronenborn和 J. Messing1978年把LacZ’ 5’端的第 13個核苷酸 G突變成 A，產(chǎn)生了一個 EcoR I切點。 M13mp2： 106 5’ATGACCATGATTACGGATTCA Me 用 N甲基 N亞硝基脲 把 G甲基化 5’ATGACCATGATTACGGATTCA 轉(zhuǎn)染 。 mG與 T配對，復制兩次后 5’ATGACCATGATTACGAATTCA EcoRI切點 用 EcoRI切 M13mp1 M13mp2 選擇能切開的 線性分子 再環(huán)化 M13mp1 107 ③ 對 M13mp2的進一步改進 在 M13mp2的 LacZ’的 5‘端加上一段人工合成的多克隆位點（ MCS）。 M13mp M13mp M13mpM13mp M13mp1 M13mp1M13mp19 對應有相同 MCS的 pUC系列載體： pUC pUC pUC pUCpUC1 pUC1 pUC19 成為 M13mp系列載體： 108 109 與 pUC18相同 M13mp18的多克隆位點 110 4. M13系列載體的優(yōu)點 （ 1）有 MCS，便于克隆不同的酶切片段 （ 2） Xgal顯色反應，可供直接選擇 （ 3）無包裝限制，克隆能力大 （ 4）可以克隆雙鏈 DNA分子中的每一條鏈 子代 M13噬菌體中包含的是單連 +DNA。 111 MCS + + + 編碼鏈 非編碼鏈 外源 DNA 不同的酶切 不同的酶切 插入 M13 vector 112 M13 RF + + + 外源 DNA 轉(zhuǎn)染 E. coli 成熟的子代 M13中 + + 113 Phage M13 replication in the host cell: + RNA pol DNA polIII 177。 RF Nicked by gene 2 protein + ssRolling circle replication, then cut and ligate Coated with gene 5 protein Gene 5 protein is replaced by gene 8 protein ect. Linear M13 phage released from the cell. 114 ① 插入外源 DNA后，遺傳穩(wěn)定性顯著下降 ② 實際克隆能力小于 1500bp。 雖無包裝限制，并非無限包裝！ 5. M13載體的缺點 115 6. 噬菌粒載體（ phagemid vectors） 由 質(zhì)粒載體 與 單鏈噬菌體載體 的復制起點結(jié)合而成的新型載體系列。 MCS 噬菌體 ori 質(zhì)粒 ori Ampr lacZ’ lacI 116 約 3000bp（比 M13?。? ② 克隆能力大 能插入 10kb的外源 DNA。 ③ 兩種復制形式 ① 分子量小 （ 1）噬菌粒載體的特點 既具有質(zhì)粒的復制起點，又具有噬菌體的復制起點。 既能在大腸桿菌中以質(zhì)粒的形式雙鏈復制，又能在噬菌體內(nèi)進行單鏈復制。 117 （ 2）常見的噬菌粒載體 噬菌粒載體 質(zhì)粒部分 單鏈噬菌體部分 輔助噬菌體 大腸桿菌寄主 pEMBL8 pUC8 f1 IR1 71/18 pRSA101 ?VX M13 M13變異株 XS127，XS101 pUC118/pUC119 pUC18/ pUC19 M13 M13K07 MV1184 pBS pUC f1 M13K07 XL1Blue 輔助噬菌體用來復制和包裝噬菌粒載體。 118 （ 3） pUC118/pUC119 ① 構(gòu)成 1） M13的基因間隔區(qū)（ IG） 2） pUC18/pUC19質(zhì)粒載體： 帶有 M13復制起點。 質(zhì)粒復制起點 Ampr lacZ’ MCS 119 MCS pUC18/pUC19 ori Ampr lacZ’ lacI M13 ori pUC118/119 120 ② pUC118/119的復制模式 兩種不同的復制模式 1）雙鏈質(zhì)粒復制模式 受 pUC本身的復制起點（來源于ColE1）的控制。 每個細胞能達到 500個拷貝。 121 來源于 M13的復制起點被 輔助噬菌體的基因 II產(chǎn)物控制。 2）單鏈滾環(huán)噬菌體復制模式 外殼蛋白 復制蛋白 輔助 M13 包裝 當寄主細胞被 輔助噬菌體 M13感染后。 122 ③ 噬菌粒載體的包裝 1）輔助噬菌體： 自身的 復制起點發(fā)生了突變 ，復制效率低下，但感染細菌后能表達出 外殼蛋白和復制蛋白 ，幫助噬菌粒載體復制。 如 M13K07等。 2）包裝： 輔助噬菌體 外殼蛋白和 復制蛋白 噬菌粒載體 ssDNA 噬菌體 123 （ 4） pBluescript 噬菌粒載體（ pBS） Stratagene公司發(fā)展的一類噬菌粒載體。 由 pUC質(zhì)粒載體、 f1噬菌體的復制起點和T T7噬菌體的啟動子 組成。 ② 特點 ① 組成 MCS兩側(cè)分別加上 T3和 T7噬菌體的啟動子。加入適當?shù)氖删w RNA聚合酶，就可以定向體外轉(zhuǎn)錄。 1）定向體外轉(zhuǎn)錄 124 2）兩種復制模式 既能以質(zhì)粒的形式復制，又能以噬菌體的形式復制包裝。 3）選擇方便 有 Ampr和 lacZ’，可以進行 Amp抗性選擇和 XgalIPTG藍白斑選擇。 4）插入方便 18個單一酶切位點的 MCS 125 SK：表示 lacZ’的 轉(zhuǎn)錄方向 是沿 MCS上的 SacI ? KpnI +（ f1+）：單鏈 復制起始方向 背離 lacZ’，能回收 lacZ’ 的編碼鏈（ +） pBluescript SK（ +/） /pBluescript KS（ +/） KS：反向（ KpnI ? S