第二章基因工程制藥新版4(編輯修改稿)
2025-11-19 22:08 本頁面
【文章內容簡介】 因導入技術。 基因槍適用于動植物、細胞培養(yǎng)物、胚胎、細菌及小型動物的轉基因。具有快速、簡便、安全、高效的特點。,基因槍注射技術,基因槍注射技術,利用脈沖電場提高細胞膜的通透性，從而使外源DNA轉移至細胞中。此法簡單、效率較高，幾乎所有細胞都可用此技術，此方法轉染的DNA不僅是線性的，還可是環(huán)狀的。 條件：電壓：300～600V 維持時間：20～100ms 溫度：0℃,電穿孔技術,磷酸鈣—DNA共沉淀法基因轉移技術,此法受二價金屬離子能促進細胞吸收外源DNA的啟發(fā)而發(fā)展起來的。當核酸以磷酸鈣—DNA共沉淀物的形式在時，細胞攝取DNA的能力顯著加強。但轉移效率較低，僅有1%~5%的外源DNA可進入受體細胞核中，約有1%DNA可在細胞中穩(wěn)定表達。,病毒介導的生物學方法,帶有外源基因的逆轉錄病毒或DNA病毒在包裝細胞內可形成完整的病毒顆粒，并被釋放到培養(yǎng)基中，感染哺乳動物細胞，能有效實現(xiàn)基因轉移。,（三）大腸桿菌中的基因導入和表達,真核基因導入大腸桿菌所用的載體 真核基因導入大腸桿菌的具體方式 影響真核基因導入大腸桿菌的因素,真核基因導入大腸桿菌所用的載體,（1）pBV220 （2）pET,pBV220,侯云德 分子病毒學家 中國工程院院士 1.分離了我國副流感病毒Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ型 2.研制出包括α1b、α2a、α2b、γ等亞型的基因工程干擾素系列產品 3.成功組建原核高效表達載體pBV220系列及pBV320系列通用型高效表達載體,（1）pBV220,已經成功用于表達ILILILILILLFNa、IFNr、TNF、GCSF、GMCSF等多種細胞因子。 [A]、結構 [B]、優(yōu)點,[A]、結構,pBV220共3665bp。共由6個部份組成： （1）pUC8的MCS （2）核糖體rrnB終止信號 （3）pBR322的第42523735位 （4）pUC18的第2066680位 （5）λ噬菌體cIts抑制基因+PR啟動子 （6）pRC23的PL啟動子+SD序列。,質粒pBV220的結構框,ori復制起始點 clts857抑制子基因，在31℃時，其基因產物具有阻抑PL活性，當溫度升高時，這種阻抑活性就喪失，PL開始指導合成mRNA。 PR啟動子1 PL啟動子2 BglII、EcoRI、SmaI、BamHI、SalI 、HindIII、 PstI限制酶切位點形成多克隆區(qū)域，在此插入外源性目的基因。 RrnB核糖體終止基因（終止子） PvuI青霉素抗性基因Ampr。,[B]、優(yōu)點,（1）可轉化任何菌株 （2）能防止出現(xiàn)“通讀”現(xiàn)象 （3）質粒分子量很小，有利于增加其拷貝數(shù)量 （4）能插入大片段的外源基因,（2）pET,pET被認為是最有潛力的系統(tǒng)。來源于T7 噬菌體。 [A]、克隆宿主可用大腸桿菌K12的HB10JM103等細胞。pET克隆到宿主體內之后，不會造成宿主的細胞損傷。 [B]、表達受宿主細胞的T7 RNA聚合酶控制。表達宿主為BL2λDE30。表達菌在LB培養(yǎng)基、或在M9培養(yǎng)基中生長良好。 [C]、表達產物可以用金屬絡合物的方式進行分離，能夠達到高純度、高收率。,MCS,pET32 a(+)以T7lac作為啟動子； pET32 a(+) 還帶有T7.Tag和HisTag融合標簽，此類標簽可用于檢測和純化相關目的蛋白； pET32a(+) 上與目的基因共表達的硫氧還蛋白可以促進二硫鍵形成，增加目的蛋白可溶性，便于分離純化。,真核基因導入大腸桿菌具體方式,共有3種方式 （1）融合蛋白 （2）非融合蛋白 （3）分泌型表達蛋白,（1）融合蛋白,[A]、定義 [B]、優(yōu)缺點 [C]、改進措施 [D]、融合蛋白的具體表達方式,[A]、定義,是指產生的蛋白質同時含有細菌蛋白+目的蛋白。 融合蛋白的氨基酸端由大腸桿菌原核基因編碼、而羧基端則由真核基因編碼。 最終表達出來的蛋白質=1條原核多肽+1條真核多肽，稱為融合蛋白。,[B]、優(yōu)缺點,優(yōu)點： （1）蛋白質在細菌體內比較穩(wěn)定，不易被細菌的酶類所降解， （2）容易實現(xiàn)高效表達， （3）基因操作簡便。 缺點： 由于蛋白質中含有細菌蛋白，會影響真核蛋白的免疫原性，只能用作抗原,不能作為人體注射用藥。,[C]、改進措施,（1）在細菌蛋白和目的蛋白間加入IleGluGlyArg，可被人體內的凝血因子Xa識別而切開。在體外，采用特異的蛋白酶（凝血因子X、膠原酶、腸激肽酶）對融合蛋白進行降解。 （2）在細菌蛋白和目的蛋白間加入Met，CNBr可專一性識別Met并切開，形成原核多肽+真核蛋白質分子，從而獲得具有生物活性的天然真核蛋白質分子。,[D]、融合蛋白的具體表達方式,融合基因融合蛋白 基因結構為“原核啟動子—原核SD序列—原核結構基因片段—真核結構基因序列—原核終止密碼子” （D1）融合表達載體的構建 （D2）常用的融合蛋白（原核細菌表達的蛋白質） （D3）融合蛋白的切除方法,關鍵： 融合蛋白與外源蛋白的閱讀框要對齊 兩個蛋白的結合位點的設計很重要，應便于下一步切除融合蛋白的操作。,（D1）融合表達載體的構建,（
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