第二章基因工程制藥新版4(編輯修改稿)
2024-11-19 22:08 本頁面
【文章內(nèi)容簡介】 因?qū)爰夹g(shù)。 基因槍適用于動(dòng)植物、細(xì)胞培養(yǎng)物、胚胎、細(xì)菌及小型動(dòng)物的轉(zhuǎn)基因。具有快速、簡便、安全、高效的特點(diǎn)。,基因槍注射技術(shù),基因槍注射技術(shù),利用脈沖電場提高細(xì)胞膜的通透性，從而使外源DNA轉(zhuǎn)移至細(xì)胞中。此法簡單、效率較高，幾乎所有細(xì)胞都可用此技術(shù)，此方法轉(zhuǎn)染的DNA不僅是線性的，還可是環(huán)狀的。 條件：電壓：300～600V 維持時(shí)間：20～100ms 溫度：0℃,電穿孔技術(shù),磷酸鈣—DNA共沉淀法基因轉(zhuǎn)移技術(shù),此法受二價(jià)金屬離子能促進(jìn)細(xì)胞吸收外源DNA的啟發(fā)而發(fā)展起來的。當(dāng)核酸以磷酸鈣—DNA共沉淀物的形式在時(shí)，細(xì)胞攝取DNA的能力顯著加強(qiáng)。但轉(zhuǎn)移效率較低，僅有1%~5%的外源DNA可進(jìn)入受體細(xì)胞核中，約有1%DNA可在細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)。,病毒介導(dǎo)的生物學(xué)方法,帶有外源基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒或DNA病毒在包裝細(xì)胞內(nèi)可形成完整的病毒顆粒，并被釋放到培養(yǎng)基中，感染哺乳動(dòng)物細(xì)胞，能有效實(shí)現(xiàn)基因轉(zhuǎn)移。,（三）大腸桿菌中的基因?qū)牒捅磉_(dá),真核基因?qū)氪竽c桿菌所用的載體 真核基因?qū)氪竽c桿菌的具體方式 影響真核基因?qū)氪竽c桿菌的因素,真核基因?qū)氪竽c桿菌所用的載體,（1）pBV220 （2）pET,pBV220,侯云德 分子病毒學(xué)家 中國工程院院士 1.分離了我國副流感病毒Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ型 2.研制出包括α1b、α2a、α2b、γ等亞型的基因工程干擾素系列產(chǎn)品 3.成功組建原核高效表達(dá)載體pBV220系列及pBV320系列通用型高效表達(dá)載體,（1）pBV220,已經(jīng)成功用于表達(dá)ILILILILILLFNa、IFNr、TNF、GCSF、GMCSF等多種細(xì)胞因子。 [A]、結(jié)構(gòu) [B]、優(yōu)點(diǎn),[A]、結(jié)構(gòu),pBV220共3665bp。共由6個(gè)部份組成： （1）pUC8的MCS （2）核糖體rrnB終止信號 （3）pBR322的第42523735位 （4）pUC18的第2066680位 （5）λ噬菌體cIts抑制基因+PR啟動(dòng)子 （6）pRC23的PL啟動(dòng)子+SD序列。,質(zhì)粒pBV220的結(jié)構(gòu)框,ori復(fù)制起始點(diǎn) clts857抑制子基因，在31℃時(shí)，其基因產(chǎn)物具有阻抑PL活性，當(dāng)溫度升高時(shí)，這種阻抑活性就喪失，PL開始指導(dǎo)合成mRNA。 PR啟動(dòng)子1 PL啟動(dòng)子2 BglII、EcoRI、SmaI、BamHI、SalI 、HindIII、 PstI限制酶切位點(diǎn)形成多克隆區(qū)域，在此插入外源性目的基因。 RrnB核糖體終止基因（終止子） PvuI青霉素抗性基因Ampr。,[B]、優(yōu)點(diǎn),（1）可轉(zhuǎn)化任何菌株 （2）能防止出現(xiàn)“通讀”現(xiàn)象 （3）質(zhì)粒分子量很小，有利于增加其拷貝數(shù)量 （4）能插入大片段的外源基因,（2）pET,pET被認(rèn)為是最有潛力的系統(tǒng)。來源于T7 噬菌體。 [A]、克隆宿主可用大腸桿菌K12的HB10JM103等細(xì)胞。pET克隆到宿主體內(nèi)之后，不會(huì)造成宿主的細(xì)胞損傷。 [B]、表達(dá)受宿主細(xì)胞的T7 RNA聚合酶控制。表達(dá)宿主為BL2λDE30。表達(dá)菌在LB培養(yǎng)基、或在M9培養(yǎng)基中生長良好。 [C]、表達(dá)產(chǎn)物可以用金屬絡(luò)合物的方式進(jìn)行分離，能夠達(dá)到高純度、高收率。,MCS,pET32 a(+)以T7lac作為啟動(dòng)子； pET32 a(+) 還帶有T7.Tag和HisTag融合標(biāo)簽，此類標(biāo)簽可用于檢測和純化相關(guān)目的蛋白； pET32a(+) 上與目的基因共表達(dá)的硫氧還蛋白可以促進(jìn)二硫鍵形成，增加目的蛋白可溶性，便于分離純化。,真核基因?qū)氪竽c桿菌具體方式,共有3種方式 （1）融合蛋白 （2）非融合蛋白 （3）分泌型表達(dá)蛋白,（1）融合蛋白,[A]、定義 [B]、優(yōu)缺點(diǎn) [C]、改進(jìn)措施 [D]、融合蛋白的具體表達(dá)方式,[A]、定義,是指產(chǎn)生的蛋白質(zhì)同時(shí)含有細(xì)菌蛋白+目的蛋白。 融合蛋白的氨基酸端由大腸桿菌原核基因編碼、而羧基端則由真核基因編碼。 最終表達(dá)出來的蛋白質(zhì)=1條原核多肽+1條真核多肽，稱為融合蛋白。,[B]、優(yōu)缺點(diǎn),優(yōu)點(diǎn)： （1）蛋白質(zhì)在細(xì)菌體內(nèi)比較穩(wěn)定，不易被細(xì)菌的酶類所降解， （2）容易實(shí)現(xiàn)高效表達(dá)， （3）基因操作簡便。 缺點(diǎn)： 由于蛋白質(zhì)中含有細(xì)菌蛋白，會(huì)影響真核蛋白的免疫原性，只能用作抗原,不能作為人體注射用藥。,[C]、改進(jìn)措施,（1）在細(xì)菌蛋白和目的蛋白間加入IleGluGlyArg，可被人體內(nèi)的凝血因子Xa識別而切開。在體外，采用特異的蛋白酶（凝血因子X、膠原酶、腸激肽酶）對融合蛋白進(jìn)行降解。 （2）在細(xì)菌蛋白和目的蛋白間加入Met，CNBr可專一性識別Met并切開，形成原核多肽+真核蛋白質(zhì)分子，從而獲得具有生物活性的天然真核蛋白質(zhì)分子。,[D]、融合蛋白的具體表達(dá)方式,融合基因融合蛋白 基因結(jié)構(gòu)為“原核啟動(dòng)子—原核SD序列—原核結(jié)構(gòu)基因片段—真核結(jié)構(gòu)基因序列—原核終止密碼子” （D1）融合表達(dá)載體的構(gòu)建 （D2）常用的融合蛋白（原核細(xì)菌表達(dá)的蛋白質(zhì)） （D3）融合蛋白的切除方法,關(guān)鍵： 融合蛋白與外源蛋白的閱讀框要對齊 兩個(gè)蛋白的結(jié)合位點(diǎn)的設(shè)計(jì)很重要，應(yīng)便于下一步切除融合蛋白的操作。,（D1）融合表達(dá)載體的構(gòu)建,（
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