第二章基因工程制藥新版3(編輯修改稿)
2024-11-19 22:08 本頁面
【文章內(nèi)容簡介】 感染大腸桿菌形成噬菌斑。以便于使得質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌內(nèi)。,F、cDNA文庫的鑒定,表型鑒定法： （1）抗性基因失活法 （2）菌落顏色 （3）噬菌斑顏色改變 分子鑒定法： （1）凝膠電泳 （2）分子雜交 （3）DNA序列測定,G、目的cDNA克隆的分離和鑒定,（1）核酸探針雜交法根據(jù)目的蛋白質(zhì)純品的氨基酸序列分析結(jié)果，人工合成相應(yīng)的單鏈寡核苷酸作為探針，從cDNA文庫分離特異的cDNA克隆。,（2）特異親合鑒定法對于那些表達水平低,不能純化得到足量蛋白質(zhì)的進行序列測定,利用一種能與靶蛋白特異結(jié)合的配體,從已構(gòu)建的表達型重組文庫中篩選該蛋白的基因。 ①已知的可在體內(nèi)與靶蛋白相互作用的蛋白/小分子化合物 ②抗靶蛋白抗原決定簇的IgG ③可被靶蛋白識別的小段DNA序列,（5）逆轉(zhuǎn)錄法的實例,通過逆轉(zhuǎn)錄法，已經(jīng)合成了下列基因克隆株： （1）人生長激素 （2）α人干擾素 （3）β人干擾素 （4）人尿激酶。,RTPCR技術(shù)法,1985，PCR發(fā)明以后，RTPCR得到了廣泛的應(yīng)用。 特點： mRNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈后，不用再合成cDNA第二鏈 只是在特異性引物作用下，擴增近181。g級的特異cDNA產(chǎn)物 通過RTPCR成功克隆的基因： IL2,3,6,GCSF、TNF、IFNγ等,是一種在體外利用酶促反應(yīng)大量獲得特異序列的基因組DNA或cDNA的專門技術(shù)，又稱為無細胞的分子克隆。,聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）,模板DNA 引物 4種dNTP Taq DNA聚合酶 含Mg2+的緩沖液。,PCR的反應(yīng)體系,（1）變性，加熱至95 ℃，使模板DNA解開成單鏈； （2）退火，溫度降至適宜，使引物與模板互補結(jié)合； （3）延伸，溫度升至72 ℃ ，DNA聚合酶以4種dNTP為底物，在引物的3’OH上，合成與模板互補的DNA新鏈。,PCR的基本反應(yīng)步驟及原理,PCR反應(yīng)條件,變性 95?C,延伸 72?C,退火 Tm5?C,5?,Primer 1,5?,Primer 2,Cycle 2,Cycle 1,5?,5?,5?,5?,5?,5?,Template DNA,5?,5?,5?,5?,5?,5?,5?,5?,PCR基本工作原理,Cycle 3,25～30 次循環(huán)后，模板DNA的含量可以擴大100萬倍以上。,篩選新基因的其它新方法,島嶼獲救PCR法,CpG島富有GC(60% )，有高含量的CpG二核苷酸。 CpG 島含有罕見的Eag I、Sac I、BssHI酶切位點，每個酶在CpG島的酶切頻率為12次/島。 CpG島是很多基因5’端的標志。 對GenBank數(shù)據(jù)庫375個基因的統(tǒng)計，幾乎所有的看家基因與40%的組織特異性基因與CpG 島相關(guān)聯(lián)。 Alu重復較均一的散布在基因組，約每3kb出現(xiàn)1次。 由CpG 島延伸至相鄰的Alu重復的探針應(yīng)能用來分離與CpG 島相關(guān)聯(lián)的基因。,選泡狀接頭及泡狀引物是為了保證PCR反應(yīng)的選擇性。泡狀引物的序列與泡狀接頭里非互補區(qū)的一條鏈的序列相同。由于泡狀引物不能與泡狀接頭里對應(yīng)的鏈互補，只有Alu引物能夠啟動PCR反應(yīng)進行第一個擴增循環(huán)，其后兩個引物均能參與擴增。這樣，不含Alu重復的DNA 片段將不能被擴增。,用罕見的限制酶切酵母人工染色體DNA，酶切片斷連上泡狀接頭，用泡狀引物和Alu特異引物PCR擴增。 所擴片斷經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離，找出特異片段來篩選cDNA文庫。,酶切片斷連上泡狀接頭,用泡狀引物和Alu特異引物PCR擴增,罕見的限制酶切,凝膠分離特異片段篩選cDNA文庫,獲得特異片段,此法會漏掉不含CpG島的基因。 如果Alu重復與CpG 島相距太遠而無法PCR擴增，相應(yīng)的基因也會漏掉。 此法對分離基因5’端十分有利，而基因5’端常是最難克隆的。,粘粒DNA庫經(jīng)限制酶酶切(也可不用酶切，用超聲處理并補平)并連上接頭，然后用5’生物素標記的引物(與接頭1個臂的序列相同)做PCR擴增。,cDNA文庫插入片斷也用載體引物行PCR，然后與生物素標記的基因組片段雜交。,基因組DNAcDNA復合物用鏈霉抗生物素蛋白覆蓋的磁珠捕捉。除掉未結(jié)合的非特異性cDNA。捕捉到的cDNA洗脫后用載體引物行PCR擴增。,表達序列的磁珠捕捉法是具有代表性，利用磁場力對cDNA文庫中目的基因進行富集的一種方法。,編碼序列富集法,鳥槍法,先將供體細胞的染色體DNA，經(jīng)過酶處理、或者物理學方法切割成基因水平的很多片段。 ↓ 將每一片段和載體進行重組。 ↓ 轉(zhuǎn)化到受體菌中進行基因增殖。 ↓ 采用適當?shù)暮Y選方法，從眾多的菌落中選出帶有目的基因的菌株。 ↓ 從選擇出的菌株中回收重組DNA,鳥槍法的優(yōu)缺點,鳥槍法的優(yōu)點采用鳥槍射擊去命中“預定目標”的原理，該方法能夠繞過直接分離目的基因的難關(guān)。 鳥槍法的難點必須有一種有效的目的基因檢測方法，常用mRNA作為探針，進行原位雜交法檢驗。,功能克隆法,可采用基因敲除技術(shù)、RNAi技術(shù)、酵母雙雜交技術(shù)及流式細胞術(shù)，從基因水平、表達調(diào)控水平、蛋白質(zhì)水平和細胞水平獲得基因功能信息。,差異顯示技術(shù),利用mRNA差異顯示
公司管理相關(guān)推薦
鄂ICP備17016276號-1