第二章基因工程制藥新版3-在線瀏覽
2024-11-19 22:08本頁面
【正文】 內(nèi)含子，可以在任何場合進行表達。 當RNA提取液流經(jīng)寡聚脫氧胸腺苷酸Oligo dT纖維素柱時，在高鹽緩沖液的作用下，mRNA被特異性地吸附在柱上，其它RNA成份則被沖刷走掉，最后，用低鹽溶液或者蒸餾水沖刷纖維素柱，mRNA就被洗脫下來。,mRNA的分離,OligodT纖維素柱,OligodT磁珠法,B、cDNA第一鏈的合成,由于mRNA的3’端常含polyA，所以可用寡聚脫氧胸腺苷酸Oligo dT做引物，在逆轉錄酶催化下，合成cDNA。,C、cDNA第二鏈的合成,先用堿水解的方法，或用RNaseH酶解的方法，除去cDNAmRNA雜交鏈中的mRNA鏈。,mRNA,mRNAcDNA Hybrid,nick,逆轉錄酶,RNase H,DNA聚合酶 T4連接酶,T4 DNA聚合酶處理形成平頭末端,Nick Translation,cDNA的合成方法,D、cDNA的克隆和重組,（D1）、用于cDNA的克隆的載體 （D2）、cDNA的片段與載體的連接,（D1）、用于cDNA的克隆的載體,當cDNA的插入片段小于10Kb時，應選用質粒載體。 表達型是指重組后插入的cDNA能夠經(jīng)過轉錄、翻譯，最終合成蛋白質。 質粒 噬菌體 表達型 PUC λgt11 非表達型 pBR322 λgt10,（D2）、cDNA的片段與載體的連接,（1）借助同型多聚體尾巴的連接方法用3末端脫氧核苷酸轉移酶催化，在cDNA的3’末端加上polyG（或者polyT）的尾巴、而在載體的末端加上polyC（或者 polyA）的尾巴，就能夠實現(xiàn)cDNA的片段與載體DNA的連接。,E、將重組體導入宿主細胞,λ噬菌體感染大腸桿菌形成噬菌斑。,F、cDNA文庫的鑒定,表型鑒定法： （1）抗性基因失活法 （2）菌落顏色 （3）噬菌斑顏色改變 分子鑒定法： （1）凝膠電泳 （2）分子雜交 （3）DNA序列測定,G、目的cDNA克隆的分離和鑒定,（1）核酸探針雜交法根據(jù)目的蛋白質純品的氨基酸序列分析結果，人工合成相應的單鏈寡核苷酸作為探針，從cDNA文庫分離特異的cDNA克隆。 ①已知的可在體內(nèi)與靶蛋白相互作用的蛋白/小分子化合物 ②抗靶蛋白抗原決定簇的IgG ③可被靶蛋白識別的小段DNA序列,（5）逆轉錄法的實例,通過逆轉錄法，已經(jīng)合成了下列基因克隆株： （1）人生長激素 （2）α人干擾素 （3）β人干擾素 （4）人尿激酶。 特點： mRNA反轉錄合成cDNA第一鏈后，不用再合成cDNA第二鏈 只是在特異性引物作用下，擴增近181。,聚合酶鏈反應（PCR）,模板DNA 引物 4種dNTP Taq DNA聚合酶 含Mg2+的緩沖液。,PCR的基本反應步驟及原理,PCR反應條件,變性 95?C,延伸 72?C,退火 Tm5?C,5?,Primer 1,5?,Primer 2,Cycle 2,Cycle 1,5?,5?,5?,5?,5?,5?,Template DNA,5?,5?,5?,5?,5?,5?,5?,5?,PCR基本工作原理,Cycle 3,25～30 次循環(huán)后，模板DNA的含量可以擴大100萬倍以上。 CpG 島含有罕見的Eag I、Sac I、BssHI酶切位點，每個酶在CpG島的酶切頻率為12次/島。 對GenBank數(shù)據(jù)庫375個基因的統(tǒng)計，幾乎所有的看家基因與40%的組織特異性基因與CpG 島相關聯(lián)。 由CpG 島延伸至相鄰的Alu重復的探針應能用來分離與CpG 島相關聯(lián)的基因。泡狀引物的序列與泡狀接頭里非互補區(qū)的一條鏈的序列相同。這樣，不含Alu重復的DNA 片段將不能被擴增。 所擴片斷經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離，找出特異片段來篩選cDNA文庫。 如果Alu重復與CpG 島相距太遠而無法PCR擴增，相應的基因也會漏掉。,粘粒DNA庫經(jīng)限制酶酶切(也可不用酶切，用超聲處理并補平)并連上接頭，然后用5’生物素標記的引物(與接頭1個臂的序列相同)做PCR擴增。,基因組DNAcDNA復合物用鏈霉抗生物素蛋白覆蓋的磁珠捕捉。捕捉到的cDNA洗脫后用載體引物行PCR擴增。,編碼序列富集法,鳥槍法,先將供體細胞的染色體DNA，經(jīng)過酶處理、或者物理學方法切割成基因水平的很多片段。 ↓ 轉化到受體菌中進行基因增殖。 ↓ 從選擇出的菌株中回收重組DNA,鳥槍法的優(yōu)缺點,鳥槍法的優(yōu)點采用鳥槍射擊去命中“預定目標”的原理，該方法能夠繞過直接分離目的基因的難關。,功能克隆法,可采用基因敲除技術、RNAi技術、酵母雙雜交技術及流式細胞術，從基因水平、表達調控水平、蛋白質水平和細胞水平獲得基因功能信息。如通過比較正常組織和腫瘤組織某些基因和蛋白質的差異表達，尋找在腫瘤細胞中的高表達基因或沉默基因，從而推測可能是癌基因或抑癌基因。通過變性聚丙烯酰胺電泳，檢測差異條帶。,四、外源DNA與載體DNA的切割與連接,DNA連接目的基因DNA片段與載體DNA，在DNA連接酶作用下，通過形成磷酸二酯鍵，最終構成重組DNA分子的過程，稱為DNA的連接。具體有插入滅活法
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