【正文】 ?來源：細菌染色體、噬菌體 /病毒?限制性內(nèi)切酶不僅受病毒感染的影響，還可隨 DNA的連接、轉(zhuǎn)導或轉(zhuǎn)染而傳給其他個體二、限制性核酸內(nèi)切酶的定義?限制性內(nèi)切酶 是一組可以特異性地識別 DNA上的某一特定序列，并將之水解的核酸酶。n 限制酶裂解 DNA雙鏈的磷酸二酯鍵n 酶切得到 5`P和3`OH一、限制性內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)二、限制性內(nèi)切酶的定義三、限制性內(nèi)切酶的命名四、限制性內(nèi)切酶的分類五、 II型限制內(nèi)切酶的基本特性六、影響酶活性的因素七、限制內(nèi)切酶的用途 第一節(jié) 限制性核酸內(nèi)切酶與 DNA分子的體外切割三、限制性核酸內(nèi)切酶的命名① 第 1個字母大寫，表示來源物種屬名的第一個字母。③ 如果細菌有不同的血清型，則有第四個字母，小寫，且與前 3個字母緊緊排在一起。Eco RI： Escherichia coli R⑤ 若從一種細菌中分離出幾種不同的酶，則根據(jù)發(fā)現(xiàn)順序用羅馬數(shù)字表示。端 24~26bp處切割方式 隨機 切割 特異 切割 特異 切割甲基化作用位點寄主特異性的位點 寄主特異性的位點 寄主特異性的位點在 DNA克隆中的用途無 十分有用 有用四、限制性核酸內(nèi)切酶的分類及主要特征一、限制性內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)二、限制性內(nèi)切酶的定義三、限制性內(nèi)切酶的命名四、限制性內(nèi)切酶的分類五、 II型限制內(nèi)切酶的基本特性六、影響酶活性的因素七、限制內(nèi)切酶的用途 第一節(jié) 限制性核酸內(nèi)切酶與 DNA分子的體外切割五、 II型限制性核酸內(nèi)切酶的基本特性? 是用途最廣、最簡單的一種限制性內(nèi)切酶。在已純化分類的 3000種限制性內(nèi)切酶中，已發(fā)現(xiàn)了超過 250種的特異識別序列。有以下 4種情況： a)大部分這類酶都以同源二聚體的形式結(jié)合到 DNA上，因而識別的是對稱序列；b)但有極少的酶作為單聚體結(jié)合到 DNA上，識別非對稱序列。這些酶的大小居中，約為 400650個氨基酸左右；它們識別 連續(xù) 的 非對稱序列 ，有一個結(jié)合識別位點的域 和一個專門 切割 DNA的 功能域 。因此一些 IIS型的酶在切割有多個識別位點的 DNA分子時，活性可能更高。有些酶識別 連續(xù)序列 ，并在識別位點的一端切開 DNA鏈；而另一些酶識別不連續(xù)的序列 (如 BcgI： CGANNNNNNTGC)，并在識別位點的兩端切開 DNA鏈，產(chǎn)生一小段含識別序列的片段。他們在 N端 由一個負責 切開 DNA的功能域 ，這個域又與 DNA修飾域連接；此外還有一到兩個 識別特異序列的功能域 構(gòu)成 C端 ，或以獨立的亞基形式存在。致，具有高度特異性 : Mg 2+ II型限制性內(nèi)切酶的特點五、 II型限制性核酸內(nèi)切酶的基本特性（ 1）限制酶識別序列的長度 限制性內(nèi)切酶在雙鏈 DNA上能夠識別的 特殊核苷酸序列被稱為 識別序列 。 切割頻率理論上為 1/4n（ n為識別序列長度），實際上與序列有關(guān)。 （ 5）限制酶切后產(chǎn)生兩個末端，末端結(jié)構(gòu)是５ ’ Ｐ和３ ’ ＯＨ4．末端種類 (切割方式 )（ 1） 5’ 黏性末端和 3’ 黏性末端 （ cohesive end） 識別位點為回文對稱結(jié)構(gòu)的序列經(jīng)限制酶切割后，產(chǎn)生的末端為黏性末端，這樣形成的兩個末端是相同的，也是互補的。如 Hae Ⅲ （ GG↓CC ）和 EcoR V（ GAT↓ATC ）五、 II型限制性核酸內(nèi)切酶的基本特性粘性末端的意義連接方便n 不同的 DNA雙鏈： 只要粘性末端堿基互補就可以連接。n 同一個 DNA分子內(nèi)連接： 通過兩個相同的粘性末端可以連接成環(huán)形分子。3’ 末端標記n 凸出的 3’ 端可以通過末端轉(zhuǎn)移酶添加幾個多聚核苷酸的尾巴（如 AAA或 TTT等）造成人工粘性末端。粘性末端的意義部分常用的限制性內(nèi)切酶（ 3）非互補黏性末端 (不對稱末端 )當識別序列為非對稱序列時，切割的 DNA 產(chǎn)物的末端是不同的。C C T C A G CG G A G T C GC C T C A G CG G A G T C G 能識別簡并順序的，如： AvaI AvaI 5’CPyCGPuG3’ CCCGGG。 CCCGAG。 概念216。KpnI GGTAC C Asp718 G GTACC SstI CCGC GG SacI CCGC GG 有一些 來源不同 的限制性酶識別的是 相同的核苷酸靶序列 ，這類酶稱為同裂酶。 用途 如：限制酶 HpaⅡ 和 MspⅠ 是一對同裂酶，共同的靶序列是 CCGG。* 現(xiàn)已研究發(fā)現(xiàn)，許多動物 DNA中 90%以上的甲基，都是在序列 CG處以 5甲基胞嘧啶的形式出現(xiàn)。同尾酶（ isocaudamer）216。216。BamH I 5180。 3180。 Bgl II5180。 3180。 Sau3A5180。 3180。 216。167。5’G 3’CCTAG GATCT3’ A5’ BamH I Bgl Ⅱ5’GGATCT3’ 3’CCTAGA5’ BamH I Bgl ⅡSau 3A同尾酶的粘性末端結(jié)合形成的新位點不能再被原來的酶識別BamH I G GATCCBgl II A GATCTMbo I, Sau3A I N GATCN酶切位點在 DNA上出現(xiàn)的頻率1. ?II型限制性內(nèi)切酶的酶切位點在 DNA上出現(xiàn)的頻率受 DNA的長度、識別位點的長度以及GC含量的影響。五、 II型限制性核酸內(nèi)切酶的基本特性? 另外一些不常見的酶識別位點相對較長，在 DNA鏈上出現(xiàn)頻率也相對較低。? 實際上由于不同生物體的 DNA堿基含量不同，酶的識別位點的分布和頻率也不同。?真核生物中， DNA中的 CG:GC=1:3，這也影響酶切位點的出現(xiàn)頻率。? 當 2個酶切位點距離非常近的時候，它們之間由于競爭結(jié)合位點，所以也會相互干擾。 酶的純度216。 DNA的甲基化程度216。 DNA分子的結(jié)構(gòu)216。? 長時間酶解不出現(xiàn)識別順序特異性的下降 。? DNA的甲基化 1. 原核生物的限制 修飾系統(tǒng)的組成成分是： 甲基化酶：對自身 DNA起修飾作用，從而使限 制性內(nèi)切核酸酶不能識別，保護自 身 DNA免受降解。因此，甲基化作用直接影響限制性內(nèi)切核酸酶的活性 ? 大多數(shù)大腸桿菌菌株中含有 Dam甲基化酶和 Dcm甲基化酶，前者可以在 GATC序列中腺嘌呤 N6位上引入甲基，后者在 CCA/TGC序列的第一個胞嘧啶 C5位置上引入甲基。而要