第二章基因工程制藥新版7-在線瀏覽
2024-11-19 22:12本頁面
【正文】 （四）目的產(chǎn)品的質(zhì)量控制 （五）產(chǎn)品的保存要求,（一）原材料的質(zhì)量控制,重組DNA序列的正確性。 所使用的載體、質(zhì)粒必須純正、而且穩(wěn)定。 每一批次的菌種不含致癌基因，無雜菌、病毒、真菌和支原體的污染。 生產(chǎn)過程控制微生物污染。保證工程菌的穩(wěn)定性，確定細(xì)胞的最高傳種代數(shù)。,（三）純化過程中的質(zhì)量控制,每一批次生產(chǎn)產(chǎn)物的一致性檢驗(yàn)。 產(chǎn)品鑒別的定性分析 純度分析 雜質(zhì)檢測 生物活性測定 穩(wěn)定性考察 產(chǎn)品一致性保證 產(chǎn)品的安全性,產(chǎn)品鑒別的定性分析,重組蛋白質(zhì)藥物常用的鑒定方法: （1）重組蛋白濃度和相對分子量的檢測 （2）特異性檢測 （3）氨基酸組成 （4）高效液相分析法（HPLC） （5）肽圖分析法 （6）部分氨基酸序列分析 （7）蛋白質(zhì)二硫鍵分析 （8）核磁共振（NMR）,（1）肽圖分析,通過酶解法、或化學(xué)降解法，對目的蛋白質(zhì)的每一段肽鏈進(jìn)行結(jié)構(gòu)和成份分析的方法?？勺鳛榛蚬こ坍a(chǎn)品與天然產(chǎn)品之間進(jìn)行精密比較的鑒別手段。 缺點(diǎn)和局限性： （1）不超過50個氨基酸組成的蛋白質(zhì)，測定精度較好。 （3）相對分子量越大，其偏差就越嚴(yán)重。,3.2氨基酸組成及順序分析,氨基酸組成 水解蛋白質(zhì)為氨基酸 全自動氨基酸分析儀或高效液相色譜進(jìn)行測定 順序分析 質(zhì)譜法 推定法：從已知基因序列推斷蛋白質(zhì)氨基酸序列 化學(xué)法（手工、自動） 水解法 Sanger法、Edman降解法、氨肽酶法 肼解法、羧肽酶法,各類氨基酸自動測序儀,（4）重組蛋白質(zhì)濃度、相對分子量測定,重組蛋白質(zhì)的濃度測定方法： （1）凱氏定氮法（蛋白質(zhì)平均含氮量為16﹪，首先測定氮的含量，進(jìn)而估算蛋白質(zhì)的含量） （2）雙縮脲法 （3）Bradford法 （4）福林酚法 （5）紫外分光光度法（芳香族氨基酸在280nm附近有最大光吸收，核酸在260nm附近有最大光吸收） 重組蛋白質(zhì)的相對分子量測定方法： （1）凝膠過濾法 （2）聚丙烯酰胺聚膠電泳法,電泳法測定未知蛋白的分子量,（5）蛋白質(zhì)二硫鍵分析,二硫鍵的巰基與蛋白質(zhì)的生物活性有著密切關(guān)系。 測定方法： （1）對氯汞苯甲酸法（PCMB） （2）5二巰基雙2硝基苯甲酸法（DTNB）,純度分析,目的蛋白質(zhì)含量測定通常根據(jù)目的蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)、生物學(xué)特性來進(jìn)行測定。 （1）蛋白質(zhì)雜質(zhì)的主要來源 （2）非蛋白質(zhì)雜質(zhì)主要類別 （3）常見的雜質(zhì)和污染物、以及檢測方法,（1）蛋白質(zhì)雜質(zhì)的主要來源,（A）殘余的宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)， （B）目的蛋白質(zhì)自身變性、由于蛋白酶引起的降解、由于冷凍脫鹽導(dǎo)致的沉淀、由于凍干引起的聚合。 （B）熱原質(zhì)和內(nèi)毒素，檢測可用鱟試劑。,（3）常見的雜質(zhì)和污染物、以及檢測方法,雜質(zhì)和污染物 常用檢測方法 1：內(nèi)毒素 鱟試劑、家兔熱原法 2：宿主細(xì)胞蛋白質(zhì) 免疫分析、SDSPAGE、CE 3：其它蛋白質(zhì)雜質(zhì)（如培養(yǎng)基） 免疫分析、SDSPAGE、HPLC、CE 4：殘余DNA NA雜交、紫外光譜、蛋白結(jié)合 5：蛋白變異 肽譜、等電點(diǎn)聚焦（IEF）、HPLC、CE 6：甲?；琢虬彼? 肽譜、IEF、HPLC、CE 7：甲硫氨酸氧化 肽譜、氨基酸分析、質(zhì)譜、Edman分析 8：產(chǎn)物變性、聚合、脫氨基 凝膠分子篩、SDSPAGE、HPLC、CE 9：單克隆抗體親和配基脫落 免疫分析、SDSPAGE 10：氨基酸取代 肽譜、氨基酸分析、質(zhì)譜、Edman分析 11：微生物污染物 微生物學(xué)檢查 12：支原體污染物 微生物學(xué)檢查 13：病毒污染物 微生物學(xué)檢查,生物活性測定,（1）免疫測定法：重組蛋白質(zhì)是一種抗原，均有相應(yīng)的抗體、或單克隆抗體，可用放射免疫分析法、酶標(biāo)免疫法測定其免疫學(xué)活性。 （3）細(xì)胞培養(yǎng)體外效價(jià)評定法： （A）細(xì)胞培養(yǎng)計(jì)數(shù)法 （B）3HTαR摻入法 （C）酶法細(xì)胞計(jì)數(shù)。也是藥品貯存條件、使用期限的主要依據(jù)。常常會在貯存過程中發(fā)生脫氨、氧化、磺酰化、聚合、降解等反應(yīng)。才能保證結(jié)果的客觀性。 只有從原料開始、到生產(chǎn)、到產(chǎn)品形成的每一步驟進(jìn)行嚴(yán)格的工藝要求、并結(jié)合嚴(yán)格的質(zhì)量檢測手段，才能保證產(chǎn)品的一致性恒定。 （2）在穩(wěn)定的pH條件下保存蛋白質(zhì)只有在很窄的pH范圍內(nèi)才能維持穩(wěn)定，即當(dāng)pH=pI（等電點(diǎn)）時(shí)，因此應(yīng)該小心調(diào)整保存蛋白質(zhì)的pH范圍。,（4）真空保存蛋白質(zhì)在真空狀態(tài)、或者在惰性氣體中密閉保存，能抵抗氧化作用。 （B）某些蛋白質(zhì)在高離子強(qiáng)度的極性環(huán)境中能長期保存，這類穩(wěn)定劑有中性鹽類。,固態(tài)保存凍干粉保存、結(jié)晶保存,蛋白質(zhì)含水超過10%時(shí)就容
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