第二章基因工程工具酶-在線瀏覽
2024-11-19 22:12本頁面
【正文】 分析,37℃ 1h,加反應液,CK,M,Buffer (10) 2.0 ?L ddH2O 約16.5 ?L DNA 0.2~1.0 ?g Enzyme 1～2U Volume 20.0 ?L,1.0kb,1.0kb,0.4kb,0.5kb,0.6kb,CK,M,T,T,①反應 體系,②混勻,③最適溫度,酶量,時間,反應終止,④電泳鑒定結(jié)果,?,在“非最適的”反應條件下,有些核酸內(nèi)切限制酶識別序列的特異性便會發(fā)生“松動”，從其“正確”識別序列以外的其它位點切割DNA分子，這種現(xiàn)象叫星號活性，用*表示。 例如：EcoRI的典型特異性是核苷酸序列GAATTC，當改變此酶的反應條件時，他的特異性由原來的6核苷酸降低為四核苷酸AATT。,?,（六）影響限制性核酸內(nèi)切酶活性的因素,影響酶活性的因素很多，最重要的有： ⑴ 酶純度 ⑵ DNA的純度 ⑶ DNA的甲基化程度 ⑷ 酶切反應的溫度與時間 ⑸ DNA的分子結(jié)構(gòu) ⑹ 限制性核酸內(nèi)切酶的緩沖液,?,（1）酶純度 引起某些酶活力變化的因素較多，包括甘油的濃度，離子的濃度，PH值，有機溶劑的存在，二價陽離子過高的酶和DNA濃度的比例。 純度不高，含有蛋白，特別是DNase加入Buffer時因有Mg2+ ，而激活降解DNA樣品，而無特異帶。,?,（4）酶切反應的溫度與時間 所有限制性內(nèi)切酶均應在標準條件下進行，大多數(shù)最適反應溫度是37℃，少數(shù)耐熱 TaqⅠ是65℃；Sma Ⅰ是25 ℃（30 ℃ ）。 （5）DNA分子的構(gòu)型 不同構(gòu)型的影響很大：消化超螺旋環(huán)狀DNA用的酶量大于線性DNA 不同位點切割能力不同 （6）限制性核酸內(nèi)切酶的反應緩沖液 Mg2+，TrisHCl，NaCl或KCl 223。,?,（七）其它水解核酸的酶 1. 水解RNA的核酸酶(Rnase):種類很多介紹五種 酶名稱 來源 最適PH 作用特點 反應式 應用 RNaseA 胰臟 7.9 切嘧啶產(chǎn)生 ApUpCpNp RNA測序 3’p嘧啶核苷 酸或以其結(jié) ApUp+Cp+Np 尾的寡核苷酸 RNaseT1 米曲霉 4.5 切G產(chǎn)生3’Gp GpGpApCpGp 同上 或以其為結(jié)尾 的寡核苷酸 Gp+Gp+ApCpGp RNaseU2黑曲霉 4.5 切A產(chǎn)生3‘AP GpApCpApAp 同上 或以其結(jié)尾的 寡核苷酸片段 GpAp+CpAp+Ap RNasephy頭絨孢菌 不切C產(chǎn)生3’Ap, GpApCpUpGp 同上 3’Gp,3’Up或以其 為結(jié)尾片段 GpApCpUpGp,RNaseH 大腸桿菌 水解DNARNA雜交 分子中的RNA,?,2 核酸酶S 來自稻谷曲霉 高度特異性于單鏈核酸的內(nèi)切酶：可催化單鏈RNA或DNA，降解成5’單核苷酸。 作用： 測定雜交分子（DNADNA)或(RNADNA)的雜交程度，即使是一對堿基沒雜交也能檢測到。,?,（一）DNA連接酶的概念與作用機制,環(huán)形DNA分子的發(fā)現(xiàn)使科學家相信一定有一種能連接這種切口的酶存在。 1970年，發(fā)現(xiàn)了T4DNA連接酶 ， 由大腸桿菌T4噬菌體基因編碼的。,?,DNA連接酶的催化反應 DNA ligase + NAD+/ATP ↓ 酶AMP復合物 ↓+DNA AMPDNA ↓ 相鄰3’OH對活化的磷原子發(fā)生親核攻擊 ↓→AMP 3’,5’磷酸二酯鍵,DNA 連接酶連接的作用機制,?,（二）連接酶種類及特性的比較,最常用,?,（三）DNA連接酶作用的特點,A. 連接的兩條鏈必須分別具有自由3’OH和5’P，而且這兩個基團彼此相鄰； B. 在羥基和磷酸基團間形成磷酸二酯鍵是一種耗能過程。 T4DNA連接酶－連接具互補堿基黏性末端和平末端， 需ATP輔助因子，活性高，常用。 OH P 是相鄰的－因此不能封閉gap，只能封閉nick.,gap NO,Nick OK,?,（四）T4 DNA連接酶連接反應的條件,連接酶反應體系,連接液滅活后最好立即轉(zhuǎn)化或儲存于48℃，時間不要太長，會降低轉(zhuǎn)化率。 溫度（通常在416℃ ） ATP的濃度(10μmol／L —1mol／L ) 連接酶濃度（一般平末端大約需1～2U，粘末端僅需0.1U） 反應時間（通常連接過夜） 插入片段和載體片段的摩爾比（ 1∶1～5∶1）,（五）影響連接反應的因素,?,（六）T4 DNA連接酶對目的DNA片段和載體連接的一般方案,1．連接反應一般在滅菌的0.20.5ml離心管中進行。 3．輕輕混勻，稍加離心，56℃水浴5min后，迅速轉(zhuǎn)入冰浴。,?,粘性末
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