基因工程3-3基因操作的工具酶-在線瀏覽
2025-02-21 14:59本頁面
【正文】 旦出現(xiàn)錯配堿基時，聚合反應(yīng)立即停止，由 3’?所以 3’?3. DNA Pol I在基因工程中的用途 :(1)(2)用于制備 DNA探針 3’核酸外切酶活性和聚合作用可以同時發(fā)生。隨著反應(yīng)的進行， 5’一側(cè)的核苷酸不斷地被移去， 3’一側(cè)的核苷酸又按序地增補，于是缺口便沿著 DNA分子按合成的方向移動 —— 缺口平移 （ Nick?l總體積中含有 1 I、 pol脫氧核糖核苷酸酶 I）是一種內(nèi)切酶，它能夠水解單鏈或雙鏈 DNA，形成帶有 5’磷酸末端的單（寡）核苷酸。?mol/L）和高濃度的未標(biāo)記的 dNTP（ 20而且就大多數(shù)實驗的要求，使用一種 32P?dNTP就足夠了，其他 3種均可采用未標(biāo)記的dNTP，或是用適量的未標(biāo)記的 dNTP稀釋每種32P?dNTP。 改變反應(yīng)體系中 DNase 大腸桿菌 DNA聚合酶 I的 Klenow片段 （ PolKlenow用蛋白酶將 DNAI dal和 36000 3’的聚合酶活性和 3’?3’的核酸外切酶活性。Klenow聚合酶可以標(biāo)記 DNA片段末端（ 5’延伸末端）。對于限制性核酸內(nèi)切酶 EcoR 而 BamH1. T4 DNA聚合酶也是一種多功能酶：(1)3’的聚合酶活性(2)5’的外切酶活性DNAI(3)5’外切酶活性將從 dsDNA的 3’末端降解，直到互補于這個dNTP的堿基出現(xiàn)為止，然后在這一位置發(fā)生取代反應(yīng)。以填充反應(yīng)標(biāo)記帶有 5’延伸末端的 dsDNA片段(2) 以取代反應(yīng)標(biāo)記帶有 3’延伸末端或平末端的dsDNA片段(4)1. 逆轉(zhuǎn)錄酶也是一個多功能酶：(1) RNA依賴的 DNA聚合酶 以 RNA鏈為模板，以帶有 3’OH 末端的 DNA片段為引物，沿 5’ ? 3’ 方向合成 DNA鏈。(2)以 ssDNA為模板，以帶有 3’OH末端的 DNA片段為引物，沿 5’?可在新合成的 DNA鏈上合成另一條互補 DNA。外切 RNA酶活性底物是 RNADNA雜交分子中的 RNA鏈，其水解方向有兩種：*5’末端外切：稱 5’?從 RNA鏈 5’外切 RNA酶2. 逆轉(zhuǎn)錄酶在基因工程中的應(yīng)用：主要用途是轉(zhuǎn)錄真核生物的 mRNA成為 cDNA，從而制備基因片段。禽成髓細胞瘤病毒（ AMV）逆轉(zhuǎn)錄酶(2) 而 MoMLV逆轉(zhuǎn)錄酶的外切 RNA酶活性較弱，更有利于制備全長的 cDNA。5’外切 DNA酶活性，故不具備校對功能，在高濃度 dNTP和 Mn2+存在下，容易出現(xiàn)核苷酸錯誤摻入。高濃度的核酸酶 SI可從缺口（ nick）或小裂縫（ gap）處降解dsDNA。3. 在基因工程中的應(yīng)用：由于核酸酶 SI能從 DNA片段中切除單鏈尾巴，因而在質(zhì)粒的重建和 DNA重組中被廣泛使用。(2) 切除 cDNA的發(fā)夾結(jié)構(gòu)。（ Mg2+為輔因子）。2. 在基因工
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