【正文】 TCCCCTAGG45Bam HⅠGTCCAGGCCTAGGATCC G+GGATCCCCTAGGHindⅡGTCGACCAGCTGGACCTG+平端切口 粘端切口46同功異源酶來源不同，但能識別和切割同一位點的限制酶，稱為 同功異源酶 。 這兩個相同的粘性末端稱為配伍未端 (patible end)。 切割 DNA分子中的磷酸二酯鍵，產(chǎn)生 5180。OH的 DNA片段。 49n 5180。 PstⅠ 識別序列 3180。 形成 3180?！璆 AATTC…3180?！瑿TTAA G…5180。P黏性末端 n 5180。 Alu Ⅰ 識別序列 3180。 切割后形成平末端 50n 限制性核酸內(nèi)切酶的用途 : ① 改造和構(gòu)建新質(zhì)粒； ② 建立 DNA物理圖譜； ③ 基因組 DNA同源性研究； ④ 基因克?。? ⑤ DNA分子雜交及序列分析； ⑥ 制備 DNA放射性探針； ⑦ DNA甲基化堿基的識別與切割等 。它能催化 DNA中相鄰的 5180。羥基末端之間形成磷酸二酯鍵，使 DNA單鏈缺口連接起來，形成完整 DNA分子。 523180。失去磷酸二酯鍵的缺口連接酶封閉缺口DNA連接酶連接雙鏈中的單鏈缺口53表 81 重組 DNA技術(shù)中常用的工具酶n 酶的名稱 功 能n 限制性核酸內(nèi)切酶 識別特異序列，切割 DNAn DNA聚合酶 ① 合成雙鏈 cDNA的第二條鏈n ② 缺口平移制作高比活探針n ③ 填補 3180。磷酸基和 3180。羥基末端磷酸化，或標(biāo)記探針n 末端轉(zhuǎn)移酶 在 3180。它 是能攜帶外源 DNA分子進(jìn)入受體細(xì)胞并進(jìn)行擴增和表達(dá)的運載工具。表達(dá)載體 (expression vector) 為使插入的外源 DNA序列可轉(zhuǎn)錄翻譯成多肽鏈而特意設(shè)計的載體稱為 表達(dá)載體 。 58 （一）克隆載體1. 質(zhì)粒 質(zhì)粒（ plasmid）是存在于細(xì)菌染色體之外的、具有自主復(fù)制能力的雙鏈環(huán)狀 DNA分子。 59特點 能在宿主細(xì)胞內(nèi)獨立自主復(fù)制；帶有某些遺傳信息 , 會賦予宿主細(xì)胞一些遺傳性狀。② 適用于組織化學(xué)方法檢測重組體。 64 n TA克隆載體 是專為克隆 PCR產(chǎn)物而設(shè)計的一種特殊質(zhì)粒載體，它們的共同點是在其多克隆位點兩側(cè)的 3180。由于大部分耐熱的 DNA聚合酶（如Taq、 Tth等）擴增時都會有在 PCR產(chǎn)物 3180。末端的 T互補連接，同時 3180。常見 TA載體有 pBST、 pGMT、 pCFT、 pGWT等。n M13噬菌體優(yōu)點： 一是允許包裝大于病毒單位長度的外源 DNA；二是它感染細(xì)菌后， 其復(fù)制型是雙鏈，分泌出來的則是單鏈 。 6869 n 為了便于 克隆外源 DNA片段 ,在野生型噬菌體基因 Ⅱ 和基因 Ⅳ 之間插入 lacy啟動子 操縱元件序列擴編碼 β 半乳糖苷酶前 145個氨基酸的核苷酸序列 ,并有多克隆位點 ,依據(jù)這些位點序列不同 ,構(gòu)成 M13mp系列 ,如 M13mp2, M13mp 10,M13mp18, M13mp19等 .n 當(dāng)細(xì)菌內(nèi)復(fù)制 型 M13的拷貝數(shù)累積到 100200后 , DNA的合成就變成不對稱 ,只有一條鏈進(jìn)行復(fù)制 ,從而產(chǎn)生大量的 DNA單鏈 ,并包裝到成熟的 噬菌體 顆粒中 ,然后排出細(xì)菌體外 .70λ噬菌體 DNA改造系統(tǒng) : λgt系列（插入型 ): 能 克隆 7kb以下的外源 DNA片段 , 適用 cDNA克隆 .EMBL系列（置換型 ): 替代片段大小為 923kb, 適用基因組克隆 . 71粘性質(zhì)粒 (cosmid)n 粘性質(zhì)粒又稱粘粒 ,由 λ噬菌體 DNA的 cos區(qū)與質(zhì)粒重新構(gòu)建的載體 ,為雙鏈環(huán)狀 DNA,具有與質(zhì)粒相同的結(jié)構(gòu) ,但克隆容量比質(zhì)粒大 ,其容量可達(dá) 4050kb. 粘性質(zhì)粒的特點為 : , 如 Ampr或 Tetr基因及其復(fù)制成分 。 。 7374（二）表達(dá)載體（ expressing vector） 表達(dá)載體是用來在受體細(xì)胞中表達(dá)外源基因的載體，它除了具有克隆載體所具有的性質(zhì)外，還需要有能表達(dá)外源基因所必需的DNA序列 （如啟動子、核糖體結(jié)合位點和轉(zhuǎn)錄終止調(diào)控序列等）。 75n pRSET載體 它是一個兩用載體， 它既可作為表達(dá)融合型蛋白的載體，也可作為表達(dá)非融合型蛋白的載體。 7677 78 n 真核表達(dá)載體 都含有一套真核表達(dá)元件，即啟動子 /增強子、克隆位點、終止信號和加工poly(A)的信號。該載體含有一個高效表達(dá)的 CMV啟動子、多克隆位點、原核細(xì)胞復(fù)制起始點、用于原核細(xì)胞篩選的 Amp抗性基因和真核細(xì)胞篩選的抗性基因 (Neor)及小牛生長激素的 poly(A)?；蚪M全長 kb，共含 2個結(jié)構(gòu)基因，分別編碼病毒復(fù)制和組裝必需的蛋白質(zhì)。 AAV載體可用于體內(nèi)或體外感染肌肉、神經(jīng)、肝及造血細(xì)胞，目前 多用于 ?地中海貧血等單基因遺傳病基因治療的載體。④ 它介導(dǎo)整合到人染色體中的外源基因能在人染色體中長期穩(wěn)定表達(dá)。n 用外源基因及其調(diào)控序列置換 AVV的結(jié)構(gòu)基因，保留其兩端的 ITR結(jié)構(gòu)，可構(gòu)建腺相關(guān)病毒重組載體，用于基因治療。82第三節(jié) 基因克隆的基本過程n 基因克隆的基本過程主要應(yīng)包括：① 目的基因的獲??；② 基因載體的選擇與構(gòu)建；③ 基因載體與目的基因的連接 （構(gòu)建 DNA重組體）；④ DNA重組體導(dǎo)入受體細(xì)胞；⑤ 含 DNA重組體細(xì)胞（轉(zhuǎn)化子 ）或菌落的篩選與鑒定。n 另外 ,近來 mRNA差異顯示技術(shù)和差異蛋白質(zhì)譜表達(dá)技術(shù) 也被用來篩選差異表達(dá)基因和功能基因。目 錄93n模板 DNAn 特異性引物n耐熱 DNA聚合酶n dNTPsn Mg2+ PCR體系基本組成成分94PCR的基本反應(yīng)步驟變性95?C延伸72?C退火Tm5?C95（一）目的基因的克?。ǘ┗虻捏w外突變（三） DNA和 RNA的微量分析（四） DNA序列測定（五）基因突變分析四、 PCR的主要用途96幾種重要的 PCR衍生技術(shù)（一）反轉(zhuǎn)錄 PCR技術(shù)（二）原位 PCR技術(shù)（三）實時 PCR技術(shù)97實時 PCR技術(shù)原理目 錄98二、基因載體的選擇與制備n 基因克隆中基因載體的選擇與構(gòu)建是一項技術(shù)性很強的工作，它直接影響到基因克隆的成敗。 99三、 DNA重組體的構(gòu)建（一）目的基因與基因載體的連接1. 粘端連接法2. 平端連接法3. 人工接頭連接法4. 同聚物加尾連接法1001. 粘性末端連接方式： (1)同一限制酶切位點連接(2)不同限制酶切位點連接配伍末端連接非配伍末端連接101Bam HⅠ 切割反應(yīng) GGATCC CCTAGGT4 DNA連接酶15186。C重組體配伍末端的連接情況和同一限制酶切位點連接相似。C重組體 載體自連 目的基因 自連目 錄1053. 同聚物加尾連接在末端轉(zhuǎn)移酶 (terminal transferase)的作用下，在 DNA片段末端加上同聚物序列、制造出粘性末端，再進(jìn)行粘端連接。3180。5180。3180。5180。3180。5180。 3180。5180。 3180。5180。 3180。5180。C重組體目 錄1074. 人工接頭 (linker)連接由平端加上新的酶切位點，再用限制酶切除產(chǎn)生粘性末端，而進(jìn)行粘端連接 。3180。 連接酶的活性能被 5mmol/L 磷酸鹽、 25mmol/L NaCl 和 mmol/L Ca2+離子所抑制。 DDT可促進(jìn) T4DNA連接酶的連接作用。 ATP的失活 往往也是連接反應(yīng)失敗的重要原因之一。 112 n 目的基因與載體 DNA的比例 : 目的基因 /載體 DNA摩爾濃度的比值一般為 2～ 3，這樣能得到較高的重組率。113 表 82 部分常用的限制性核酸內(nèi)切酶n DNA總濃度 pMV/pMI 轉(zhuǎn)化子 / 重組子 %n (V+I） (μgVDNA)n (μg/mL) 1 2:1 *105 n 5 2:1 *105 n 10 2:1 *105 14n 20 2:1 *105 22n 50 2:1 *105 n 1 1:2 *105 n 10 1:2 *105 30n 20 1:2 *105 22114四、重組 DNA導(dǎo)入受體細(xì)胞 細(xì)胞 (細(xì)菌