基因工程第6章dna重組的操作1-在線瀏覽
2025-02-08 17:55本頁面
【正文】 取兩種細(xì)胞的總 mRNA,反轉(zhuǎn)錄后成為 2種 cDNAl 以一定的引物作隨機(jī)聚合酶鏈反應(yīng)l 通過擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳分析 ,分離出不同樣品間的差異條帶l 將差異 DNA做成探針l 在 cDNA文庫或基因組文庫中篩選基因并作功能分析 優(yōu)點(diǎn)：216。 可同時(shí)比較多種細(xì)胞類型216。 用量少，操作簡單，快速高效缺點(diǎn) ：216。 聚丙烯酰胺凝膠電泳分離片段小于 500bp216。 缺乏定量分析手段，判斷差異條帶有難度第六章 DNA重組的操作第一節(jié) 受體細(xì)胞216。 能使重組 DNA分子穩(wěn)定存在于細(xì)胞中216。 遺傳穩(wěn)定性高216。 有利于外源基因的高效分泌表達(dá)216。 具有較好的轉(zhuǎn)譯后加工機(jī)制216。 大多原核生物沒有堅(jiān)硬的細(xì)胞壁216。 基因組簡單，便于對(duì)外源基因進(jìn)行遺傳分析216。216。 缺乏蛋白質(zhì)加工系統(tǒng)216。 大腸桿菌 人胰島素、生長素、干擾素等216。 藍(lán)藻 易于表達(dá)植物基因真菌細(xì)胞低等真核生物酵母菌：以芽殖或裂殖方式進(jìn)行無性繁殖的單細(xì)胞真核微生物，易于表達(dá)外源真核基因216。 具有真核生物蛋白翻譯后修飾加工系統(tǒng)216。 培養(yǎng)簡單216。 堅(jiān)硬的細(xì)胞壁216。 攝取外源片斷全能性：在合適的培養(yǎng)條件下，一個(gè)分離的活細(xì)胞可分化成植株。 生產(chǎn)天然狀態(tài)的復(fù)雜蛋白質(zhì)216。 動(dòng)物品種的遺傳改良216。定義216。感受態(tài)細(xì)胞 P139216。l 轉(zhuǎn)化子 （ transformant）： 通過轉(zhuǎn)化方式而形成的雜種后代。3. 感受態(tài) （ petence）感受態(tài)：指受體細(xì)胞最易接受外源 DNA片斷并能實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)化的一種生理狀態(tài)。肺炎鏈球菌 對(duì)數(shù)生長后期芽孢桿菌屬 指數(shù)期末和穩(wěn)定期大腸桿菌 剛進(jìn)入對(duì)數(shù)期DH5α菌株的 OD600 為 ,細(xì)胞密度在 5107 個(gè) /ml左右 大腸桿菌216。 細(xì)胞表面的結(jié)構(gòu)和組成與革蘭氏陽性菌不同216。 人工制備感受態(tài)細(xì)胞4. 轉(zhuǎn)化過程大腸桿菌的轉(zhuǎn)化方法：216。 電穿孔轉(zhuǎn)化法216。 培養(yǎng) 生命活動(dòng)旺盛的菌體 菌種分純活化，擴(kuò)大培養(yǎng)，處于對(duì)數(shù)生長期216。 化合物處理 含 CaCl2 無菌 預(yù)冷緩沖液處理216。l 細(xì)胞生長密度以剛進(jìn)入 對(duì)數(shù)生長期 時(shí)為好，可通過監(jiān)測(cè)培養(yǎng)液的 OD600 來控制。密度過高或不足均會(huì)影響轉(zhuǎn)化效率。l 轉(zhuǎn)化效率與外源 DNA的濃度在一定范圍內(nèi)成正比 ,但當(dāng)加入的外源 DNA的量過多或體積過大時(shí) ,轉(zhuǎn)化效率就會(huì)降低。一般情況下 ,DNA溶液的體積不應(yīng)超過感受態(tài)細(xì)胞體積的 5％。 4. 防止雜菌和雜 DNA的污染：l 整個(gè)操作過程均應(yīng)在 無菌條件下進(jìn)行 ，所用器皿，如離心管， tip頭等最好是新的，并經(jīng)高壓滅菌處理， 所有的試劑都要滅菌 ，且注意防止被其它試劑、 DNA酶或雜 DNA所污染，否則均會(huì)影響轉(zhuǎn)化效率或雜 DNA的轉(zhuǎn)入，為以后的篩選、鑒定帶來不必要的麻煩。L1 CaCl2溶液渦旋， 4℃下 12,000 rpm離心 30秒 ,盡量去除上清沉淀以 50100μL 預(yù)冷的 細(xì)胞的轉(zhuǎn)化2ul重組 DNA 50ul感受態(tài)細(xì)胞混勻＋↓冰浴 30min42℃ 熱激 90～ 120S↓↓冰浴 2min復(fù)蘇：加入 450ul液態(tài) LB培養(yǎng)基， 37 ℃ 輕緩振蕩培養(yǎng)（ 150rpm）， ～ 2h↓→取 30～ 50u
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