基因工程第6章dna重組的操作1(已修改)
2025-01-15 17:55 本頁面
【正文】 Review第三部分 目的基因的分離目的序列已知：l 一般采用 PCR技術(shù)或分子雜交技術(shù)分離克隆目的基因 目的序列未知：l 差異表達(dá)序列l(wèi) 無差異表達(dá)的目的序列，可采用文庫篩選法、功能蛋白分離法、序列克隆法一、目的基因的功能克隆l 根據(jù)蛋白質(zhì)的基本生化特性這一功能信息，在獲知基因的功能后克隆l 其具體作法是 :在純化相應(yīng)的編碼蛋白后構(gòu)建 cDNA文庫或基因組文庫，然后從文庫中篩選目的基因l (1)將純化的蛋白質(zhì)進(jìn)行氨基酸測序，據(jù)此合成 寡核苷酸探針 從 cDNA庫或基因組文庫中篩選編碼基因l (2)將相應(yīng)的編碼蛋白制成相應(yīng) 抗體探針 ，從 cDNA表達(dá)文庫中篩選相應(yīng)克隆。二、 序列克隆法l 根據(jù)已知基因序列或同源基因序列分離目的基因l 采用核酸探針雜交篩選或用 PCR技術(shù)進(jìn)行分離三、差別雜交法l 適用范圍：l 組織 特異性表達(dá) 或特定發(fā)育階段表達(dá)的基因l 受生長因子調(diào)節(jié)的基因l 經(jīng)特殊處理誘導(dǎo)表達(dá)的基因應(yīng)用前提 ：基因在兩種不同的細(xì)胞群體中的差異性表達(dá)（一個(gè)細(xì)胞群體中正常表達(dá)，另一個(gè)細(xì)胞群體中目的基因不表達(dá)）?；具^程l 制備兩種細(xì)胞群體的的 mRNA提取物l 以兩種總 mRNA或 cDNA為探針l 以表達(dá)目的基因的細(xì)胞群體構(gòu)建 cDNA文庫有目的基因表達(dá)的 mRNA探針，重組體菌落陽性反應(yīng)目的基因不表達(dá)的 mRNA探針，除目的基因之外，其余菌落都為陽性反應(yīng) 比較底片，對照原板，可挑選出含選目的基因的菌落cDNA文庫母板目的基因有表達(dá) 目的基因無表達(dá)無有 無有說明含目的基因說明含目的基因四、減法雜交技術(shù)l 又稱差減雜交、扣除雜交、減數(shù)雜交、消減雜交l 本質(zhì)：盡量 去除兩種樣品中普遍共同存在的基因序列 ，從而使目的基因序列得到有效的富集，從而提高基因篩選分離的敏感性兩種策略：l mRNA減法雜交l 基因組減法雜交mRNA減法雜交l 提取表達(dá)目的基因的細(xì)胞 mRNA，反轉(zhuǎn)錄成 cDNAl 提取不表達(dá)目的基因的細(xì)胞 mRNAl 過量雜交l 兩種組織中均表達(dá)的基因產(chǎn)物形成 cDNA/mRNA雜交分子l 特異 mRNA反轉(zhuǎn)錄的 cDNA片段仍保持單鏈減數(shù)雜交技術(shù)分離差異表達(dá)基因DNA/RNA雜交分子可結(jié)合在羥基磷灰石柱上，而游離的單鏈 cDNA則過柱流出。回收的 cDNA轉(zhuǎn)變?yōu)殡p鏈cDNA后克隆倒適當(dāng)?shù)妮d體中，就成為一個(gè)減數(shù)文庫。五、 mRNA差別顯示技術(shù)l 又稱為差別顯示反轉(zhuǎn)錄 PCR（ DDRTPCR）l 目的序列未知， 1992年由美國哈佛大學(xué)醫(yī)學(xué)分校 DenaFarber研究所的兩位科學(xué)家 Liang和 Pardee首次提出的，并運(yùn)用這種方法來分離一對培養(yǎng)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞中差別表達(dá)的基因。至今，運(yùn)用 mRNA差別顯示技術(shù)分離、鑒定的差別表達(dá)基因大約有 300多個(gè)。3 ’端錨定引物l 錨定引物的通式是 oligo(dT)12MN，其中 M為 A、C、 G中的任意一種， N為 A、 C、 G或 T中的任意一種，所以 共有 12種 oligo(dT)12MN引物，用這 12種引物分別對同一總 RNA樣品進(jìn)行 cDNA合成 ，即進(jìn)行 12次不同的反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，每一種 3 ’端錨定引物，都能夠把總 mRNA群體的 1／ 12分子反轉(zhuǎn)錄成 mRNAcDNA雜交分子。l 這樣可以將整個(gè) mRNA群體在 cDNA水平上，分成大致相等但序列結(jié)構(gòu)不同的 12份亞群體。這一過程叫做 差異顯示反
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