14章基因工程-在線瀏覽
2025-02-16 00:02本頁面
【正文】 胞釋放出來 、 再次感染另一 （ 供體 ） 細(xì)胞時(shí) ， 發(fā)生在供體細(xì)胞與受體細(xì)胞之間的 DNA轉(zhuǎn)移及基因重組即為 轉(zhuǎn)導(dǎo)作用 。 ? 例 （二）細(xì)菌的特異位點(diǎn)重組 沙門氏菌 H片段倒位決定鞭毛相轉(zhuǎn)變 ? hix為反向重復(fù)序列 ， 它們之間的 H片段可在 Hin控制下進(jìn)行特異位點(diǎn)重組 (倒位 )。 rH1為 H1的阻遏蛋白基因 。 某些基因的位置在基因組中是可以變動(dòng)的 ， 如：插入序列 ， 轉(zhuǎn)座子 ? ? 插入序列 (insertion sequences, IS)組成： ?二個(gè)分離的反向重復(fù)序列 (inverted repeats,IR) ?特有的正向重復(fù)序列 ?一個(gè)轉(zhuǎn)座酶（ transposase)編碼基因 （ 當(dāng)轉(zhuǎn)座酶基因表達(dá)時(shí)，即可引起該序列的轉(zhuǎn)座） IR Transposase Gene IR 發(fā)生形式： ?保守性轉(zhuǎn)座 (conservative transposition) ?復(fù)制性轉(zhuǎn)座 (duplicative transposition) （一）插入序列轉(zhuǎn)座 ? 插入序列的復(fù)制性轉(zhuǎn)座 ? （二）轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)座 “如果你能腳踏實(shí)地從事研究并如實(shí)報(bào)告觀察結(jié)果，同時(shí)保持健康長(zhǎng)壽，那么，你有可能獲諾貝爾獎(jiǎng)。 轉(zhuǎn)座子組成： 反向重復(fù)序列 轉(zhuǎn)座酶編碼基因 抗生素抗性等有用的基因 IR IR Transposase Gene 有用基因 ? 許多轉(zhuǎn)座子中，它的側(cè)翼序列本身就是插入序列 ? 由轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)的轉(zhuǎn)座 ? 免疫球蛋白重鏈基因 由一組可變區(qū)基因 （ VH） 和一組恒定區(qū)基因 （ CH） 構(gòu)成 ， 通過這些基因的選擇性轉(zhuǎn)座和重組 ， 就可以轉(zhuǎn)錄表達(dá)出各種各樣的免疫球蛋白重鏈 ， 以對(duì)付不同的抗原 。 ? 廣泛的分為三個(gè)水平： ? 整體水平 （ 如 生物有性雜交 ） ? 細(xì)胞水平 （ 如 單克隆抗體技術(shù) ） ? 分子水平 （ 如 構(gòu)建重組體 ） ? 一 、 重組 DNA技術(shù)相關(guān)概念 克隆 (clone) 來自同一始祖的相同副本或拷貝的集合。 （一） DNA克隆 ? 技術(shù)水平： 分子克隆 (即 DNA 克隆 ) 細(xì)胞克隆 個(gè)體克?。▌?dòng)物或植物） ? 應(yīng)用酶學(xué)的方法 ， 在體外將各種來源的遺傳物質(zhì) （ 同源的或異源的 、 原核的或真核的 、 天然的或人工的 DNA） 與載體 DNA接合成一具有自我復(fù)制能力的 DNA分子 —— 復(fù)制子 (replicon)， 繼而通過轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞 ， 篩選出含有目的基因的轉(zhuǎn)化子細(xì)胞 ， 再進(jìn)行擴(kuò)增提取獲得大量同一DNA分子 ， 也稱 基 因 克 隆 或 重 組 DNA (rebinant DNA) 。 ? （二）工具酶 ? 限制性核酸內(nèi)切酶 ? DNA聚合酶 Ⅰ ? 逆轉(zhuǎn)錄酶 ? T4DNA連接酶 ? 堿性磷酸酶 ? 末端轉(zhuǎn)移酶 ? Taq DNA聚合酶 ? 重組 DNA技術(shù)中常用的工具酶 工 具 酶 功 能 限制性核酸內(nèi)切酶 識(shí)別特異序列，切割 DNA DNA連接酶 催化 DNA中相鄰的 5180。羥基末端之間形成磷酸二酯鍵，使 DNA切口封合或使兩個(gè) DNA分子或片段連接 DNA聚合酶 Ⅰ ① 合成雙鏈 cDNA分子或片段連接 ② 缺口平移制作高比活探針 ③ DNA序列分析 ④ 填補(bǔ) 3180。常用于 cDNA第二鏈合成，雙鏈 DNA 3?末端標(biāo)記等 反轉(zhuǎn)錄酶 ① 合成 cDNA ② 替代 DNA聚合酶 I進(jìn)行填補(bǔ)，標(biāo)記或 DNA序列分析 多聚核苷酸激酶 催化多聚核苷酸 5180。羥基末端進(jìn)行同質(zhì)多聚物加尾 堿性磷酸酶 切除末端磷酸基 ? 限制性核酸內(nèi)切酶 (restriction endonuclease, RE) 限制性核酸內(nèi)切酶 :是識(shí)別 DNA的特異序列 , 并在識(shí)別位點(diǎn)或其周圍切割雙鏈 DNA的一類內(nèi)切酶。 作用 ? 第一個(gè)字母取自產(chǎn)生該酶的細(xì)菌屬名 ， 用大寫； 第二、第三個(gè)字母是該細(xì)菌的種名，用小寫； 第四個(gè)字母代表株； 用羅馬數(shù)字表示發(fā)現(xiàn)的先后次序。 GGATCC CCTAGG G CCTAG GATCC G + Bam HⅠ GGATCC CCTAGG G CCTAG GATCC G + BstⅠ 同功異源酶 ? 有些限制性內(nèi)切酶雖然識(shí)別序列不完全相同 ， 但切割 DNA后 ， 產(chǎn)生相同的粘性末端 ，稱為 同尾酶 。 Bam HⅠ Bg lⅡ GGATCC CCTAGG AGATCT TCTAGA G CCTAG GATCC G + + A TCTAG GATCT A 同尾酶 ? （三）目的基因 ? cDNA (plementary DNA) ? 基因組 DNA (genomic DNA) ? （四）基因載體 定義 為攜帶目的基因，實(shí)現(xiàn)其無性繁殖或表達(dá)有意義的蛋白質(zhì)所采用的一些 DNA分子。 表達(dá)載體 (expression vector) 為使插入的外源 DNA序列可轉(zhuǎn)錄翻譯成多肽鏈而特意設(shè)計(jì)的載體稱為 表達(dá)載體 。 ? 生物安全 ? 1. 質(zhì)粒 (plasmid) 特點(diǎn) 能在宿主細(xì)胞內(nèi)獨(dú)立自主復(fù)制；帶有某些遺傳信息 , 會(huì)賦予宿主細(xì)胞一些遺傳性狀 ?？?
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