【正文】 這是一類 溫度敏感型復(fù)制控制 質(zhì)粒。 如 pBEU pBEU2。 35 （ 4） 插入失活型質(zhì)粒載體 載體的克隆位點(diǎn)位于其某一個(gè)選擇性標(biāo)記基因內(nèi)部。 抗菌素抗性 外源 DNA 無抗菌素抗性 36 （ 5） 正選擇的質(zhì)粒載體 如 pUR pTR262等。 直接選擇轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞。 Direct selection vectors 37 （ 6） 表達(dá)型質(zhì)粒載體 主要用來使外源基因表達(dá)出蛋白質(zhì)產(chǎn)物。 注意啟動(dòng)子的性質(zhì)，終止子、起始密碼、終止密碼的閱讀正確。 1）普通載體元件 ① 表達(dá)載體的 結(jié)構(gòu) 39 40 重要的質(zhì)粒載體 ? pBR322 ? pUC18/19 41 pSP2124質(zhì)粒的 Ampr基因 1. pBR322： （ 1）元件來源 F. Bolivar和 . Rodriguez人工構(gòu)建載體。 42 （ 2）長度 4363bp （ 3）選擇標(biāo)記 氨芐青霉素和四環(huán)素抗性。 24個(gè)克隆位點(diǎn)。 獲得載體的寄主細(xì)胞 ? 在 Amp或 Tet其中之一 中死亡。不能通過接合轉(zhuǎn)移。 10kb的 DNA在純化過程中容易斷裂。 （ 6） pBR322的缺點(diǎn) 能夠被 ColK質(zhì)粒編碼的 mob蛋白識(shí)別，如果再有 F質(zhì)粒的參與，就有可能轉(zhuǎn)移！ 48 ① 刪除 mob識(shí)別位點(diǎn) （如質(zhì)粒 pBR32 pAT153等）。 （ 7） PBR322的改進(jìn) 49 pBR325： 在 pBR322位點(diǎn)上接入一段來自噬菌體 PICm的 HaeII酶切片斷（帶有氯霉素抗性基因 cmlr）。 使 EcoRI 也成為插入失活型位點(diǎn)。 pUC pUC pUC pUCpUC1 pUC1 pUC19 51 ① 復(fù)制起點(diǎn) pBR322的 ori 但其上失去了克隆位點(diǎn)。 pBR322的 Ampr基因 52 （ 2）長度 約 （ 3）克隆位點(diǎn) 10個(gè)連續(xù)的單一限制酶切位點(diǎn)，位于 lacZ’基因的 5’端。 （ 4）選擇標(biāo)記 藍(lán)白斑選擇原理： ① Xgal （ 5Bromo4chloro3indolyl?Dgalactoside） 56 ?半乳糖苷酶 能把無色的化合物 X－gal分解成半乳糖和一個(gè) 深藍(lán)色 的物質(zhì) 5溴 4氯靛藍(lán)。 lacZ只有在 4聚體的狀態(tài)下才有功能 . C端大部分 N端的 1141aa C端大部分 N端的 1141aa C端大部分 N端的 1141aa C端大部分 N端的 1141aa 4聚體 58 2）受體菌： lacZ突變（ lacZ?M15） 受體菌基因組的 ?半乳糖苷酶基因的氨基端有缺失（缺失 ?肽），只編碼 C端序列，不能形成活性酶，因而不能分解 X－ gal 受體菌株： JM系列 、 TG TGXL1blue、 XS12 XS10 KK218MV118 DH5a 59 pUC質(zhì)粒載體上的 lacZ’ 編碼 ?肽與這個(gè)缺失突變的 ?半乳糖苷酶 “ 互補(bǔ) ” ，使它能形成 4聚體。產(chǎn)生藍(lán)色物質(zhì)。不能互補(bǔ)。能誘導(dǎo) lac操縱子的啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄，使受體菌基因組中的 lacZ 的 C端部分 和載體的 lacZ’?肽都表達(dá)。 但載體 MCS上插入外源 DNA后，仍然不能產(chǎn)生 ?肽！ IPTG 62 通過看培養(yǎng)皿上的菌斑的顏色就能直接知道是否有 DNA插入。 MCS有插入時(shí)，不互補(bǔ)，白菌斑。且有抗菌素抗性 在含抗菌素和 Xgal的培養(yǎng)基上培養(yǎng) 有藍(lán)色菌斑生長 帶外源 DNA插入的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的受體菌 載體產(chǎn)物失活，不能互補(bǔ) ?半乳糖苷酶 的缺失。 ② 選擇方便 Xgal顯色、抗菌素雙重直接選擇。 ④ 測(cè)序方便 66 pUC的 MCS與 M13噬菌體載體的 MCS完全相同，便于把外源 DNA轉(zhuǎn)移到 M13載體上測(cè)序。 與 pUC的主要區(qū)別是在 MCS的兩側(cè)分別加了一個(gè)噬菌體 啟動(dòng)子 T7和 SP6。 68 ① 如果加入純化的 T7或 SP6 RNA聚合酶，在試管里就可以轉(zhuǎn)錄 mRNA ② 外源基因正接反接都可以轉(zhuǎn)錄。 2. pGEM4Z： 與 pGEM3Z相同，只是 T7啟動(dòng)子和SP6啟動(dòng)子的 位置互換 。 （ shuttle plasmid vectors） 70 Yeast復(fù)制起點(diǎn) Yeast選擇標(biāo)記 MCS 大腸桿菌 ?枯草桿菌穿梭載體 大腸桿菌 ?釀酒酵母穿梭載體 大腸桿菌 ?動(dòng)物細(xì)胞穿梭載體 （ 2）常用的穿梭質(zhì)粒載體 71 （ 3）穿梭載體的優(yōu)點(diǎn) ② 也能利用其它細(xì)胞系統(tǒng)（酵母、枯草桿菌、哺乳動(dòng)物細(xì)胞等）進(jìn)行基因表達(dá)。 克隆、構(gòu)建 表達(dá) Animal cell ① 利用大腸桿菌進(jìn)行基因克隆、表達(dá) 72 73 p A M 2 67 3 1 3 b pP G A L 1T 7 p r o m o t e rA m p i c i l l i nU R A 3f 1 o riS r P C S 1p U C o ri2 μ o r i g i nC Y C 1 T TB a m H I ( 1 9 7 7 )K p n I ( 5 1 2 )74 七、質(zhì)粒載體的不穩(wěn)定性 1. 質(zhì)粒穩(wěn)定遺傳必須的兩個(gè)條件： （ 1）每個(gè)世代、每個(gè)質(zhì)粒至少要復(fù)制一次 （ 2）在細(xì)胞分裂時(shí)，復(fù)制過的質(zhì)粒必須分 配到兩個(gè)子細(xì)胞中。 （ 1）主動(dòng)分配 天然質(zhì)粒。 76 人工構(gòu)建的質(zhì)粒載體 缺失了 par區(qū) ，只能以隨機(jī)分配方式分到子細(xì)胞中。 （一般情況下也能保證質(zhì)粒的穩(wěn)定遺傳） （ 2）隨機(jī)分配 但在一定條件下會(huì)出現(xiàn)質(zhì)粒丟失的現(xiàn)象。 3. 分離的不穩(wěn)定性 （ segregation instability） 78 4. 結(jié)構(gòu)的不穩(wěn)定性 （ structural instability） 寄主基因組的 IS序列插入質(zhì)粒、質(zhì)粒間的同源重組等都會(huì)使質(zhì)粒發(fā)生插入或缺失。 ① 復(fù)制負(fù)荷 減緩的程度與質(zhì)粒的分子量成正比。 （ 2）質(zhì)粒載體的拷貝數(shù) 低拷貝數(shù)的質(zhì)粒的差度小，遺傳穩(wěn)定。 高拷貝數(shù)的質(zhì)粒載體差度大，擁有少量拷貝數(shù)的菌體多，發(fā)生丟失的可能性大。 （ 3）寄主菌的重組體系 二聚體災(zāi)難（ dimer catastrophe）： 含有大分子量插入片斷的質(zhì)粒載體普遍能形成質(zhì)粒寡聚體。 82 第二節(jié) 噬菌體載體 83 噬菌體是一類細(xì)菌病毒（ Bacteriophage）。 T4 Bacteriophage 84 single linear DNA (about 182,000 bp) T2 Genomic DNA 85 86 噬菌體的一般生物特性 可脫離寄主細(xì)胞生存，但不能進(jìn)行復(fù)制。 88 分為兩種： 1. 溶菌周期： 二、噬菌體的生活周期 感染細(xì)菌后立即在菌體內(nèi)復(fù)制和合成蛋白質(zhì)外殼，重新組裝成噬菌體顆粒，并導(dǎo)致細(xì)菌細(xì)胞解體，釋放出大量子代噬菌體。形成這一過程稱為溶源化（ lysogenization)。 溫和噬菌體（ temperate phage) 原噬菌體（ prophage)： 92 溫和噬菌體：既能進(jìn)入溶菌生命周期又能進(jìn)入溶 源生命周期。 95 三、單鏈?zhǔn)删w載體 iii) M1 f fd 噬菌體 單鏈環(huán)狀 DNA的絲狀大腸桿菌噬菌體： M13 噬菌體 96 （ 2）復(fù)制型（ RF）是雙鏈環(huán)狀 DNA。并產(chǎn)生噬菌斑。 （ 1） +DNA。 97 2. M13 噬菌體 RF dsDNA在寄主細(xì)胞內(nèi)以高拷貝形式存在。 M13噬菌體只感染 雄性 大腸桿菌。 6407 bp。 （ 1）克隆區(qū)域的選定 ① 基因間隔區(qū)（ inter genic region, IG區(qū)） IG區(qū)內(nèi)只有一個(gè) BsuI 切點(diǎn)。 ② 酶切位點(diǎn) 102 M13 J. Messing證明， IG區(qū)存在 M13的 復(fù)制起點(diǎn) ，但可以插入外源 DNA而不影響 M13噬菌體的活力。 利用 ?肽序列中的三個(gè)單一酶切位點(diǎn)（ Bgl II、 Ava II 和 Pvu I）。 ① M13載體系列的命名 M13mpn n代表系列數(shù)字 ② 對(duì) M13mp1的改進(jìn) B. Gronenborn和 J. Messing1978年把LacZ’ 5’端的第 13個(gè)核苷酸 G突變成 A，產(chǎn)生了一個(gè) EcoR I切點(diǎn)。 mG與 T配對(duì)，復(fù)制兩次后 5’ATGACCATGATTACGAATTCA EcoRI切點(diǎn) 用 EcoRI切 M13mp1 M13mp2 選擇能切開的 線性分子 再環(huán)化 M13mp1 107 ③ 對(duì) M13mp2的進(jìn)一步改進(jìn) 在 M13mp2的 LacZ’的 5‘端加上一段人工合成的多克隆位點(diǎn)（ MCS）。 111 MCS + + + 編碼鏈 非編碼鏈 外源 DNA 不同的酶切 不同的酶切 插入 M13 vector 112 M13 RF + + + 外源 DNA 轉(zhuǎn)染 E. coli 成熟的子代 M13中 + + 113 Phage M13 replication in the host cell: + RNA pol DNA polIII 177。 雖無包裝限制，并非無限包裝！ 5. M13載體的缺點(diǎn) 115 6. 噬菌粒載體（ phagemid vectors） 由 質(zhì)粒載體 與 單鏈?zhǔn)删w載體 的復(fù)制起點(diǎn)結(jié)合而成的新型載體系列。 ③ 兩種復(fù)制形式 ① 分子量小 （ 1）噬菌粒載體的特點(diǎn) 既具有質(zhì)粒的復(fù)制起點(diǎn)，又具有噬菌體的復(fù)制起點(diǎn)。 117 （ 2）常見的噬菌粒載體 噬菌粒載體 質(zhì)粒部分 單鏈?zhǔn)删w部分 輔助噬菌體 大腸桿菌寄主 pEMBL8 pUC8 f1 IR1 71/18 pRSA101 ?VX M13 M13變異株 XS127，XS101 pUC118/pUC119 pUC18/ pUC19 M13 M13K07 MV1184 pBS pUC f1 M13K07 XL1Blue 輔助噬菌體用來復(fù)制和包裝噬菌粒載體。 質(zhì)粒復(fù)制起點(diǎn) Ampr lacZ’ MCS 119 MCS pUC18/pUC19 ori Ampr lacZ’ lacI M13 ori pUC118/119 120 ② pUC118/119的復(fù)制模式 兩種不同的復(fù)制模式 1）雙鏈質(zhì)粒復(fù)制模式 受 pUC本身的復(fù)制起點(diǎn)（來源于ColE1）的控制。 121 來源于 M13的復(fù)制起點(diǎn)被 輔助噬菌體的基因 II產(chǎn)物控制。 122 ③ 噬菌粒載體的包裝 1）輔助噬菌體： 自身的 復(fù)制起點(diǎn)發(fā)生了突變 ，復(fù)制效率低下，但感染細(xì)菌后能表達(dá)出 外殼蛋白和復(fù)制蛋白 ，幫助噬菌粒載體復(fù)制。 2）包裝： 輔助噬菌體 外殼蛋白和 復(fù)制蛋白 噬菌粒載體 ssDNA 噬菌體 123 （ 4） pBluescript 噬菌粒載體（ pBS） Stratagene公司發(fā)展的一類噬菌粒載體。 ② 特點(diǎn) ① 組成 MCS兩側(cè)分別加上 T3和 T7噬菌體的啟動(dòng)子。 1）定向體外轉(zhuǎn)錄 124 2）兩種復(fù)制模式 既能以質(zhì)粒的形式復(fù)制，又能以噬菌體的形式復(fù)制包裝。 4）插入方便 18個(gè)單一酶切位點(diǎn)的 MCS 125 SK：表示 lacZ’的 轉(zhuǎn)錄方向 是沿 MCS上的 SacI ? KpnI +（ f1+）：?jiǎn)捂?復(fù)制起始方向 背離 lacZ’，能回收 lacZ’ 的編碼鏈（ +）