hxy-第四章-目的基因的獲取-在線瀏覽
2025-06-24 18:09本頁面
【正文】 位點(diǎn)相連。 （ 2）高速攪拌 1500轉(zhuǎn) /分下攪拌 30min，可產(chǎn)生約 8kb的隨機(jī)片斷。 第二節(jié) 化學(xué)合成目的基因 一、目前常用的方法 磷酸二酯法、 磷酸三酯法、 亞磷酸三酯法、 固相合成法 自動(dòng)化合成法。 二、 化學(xué)合成 DNA片斷的組裝 用 T4多核苷酸激酶 使各個(gè)片段的 5’端帶上磷酸。 （ 2） 5’端磷酸化 （ 1）互補(bǔ)配對(duì) （合成的 DNA單鏈的 5’端是 OH） T4 DNA連接酶 T4多核苷酸激酶 使 5’OH磷酸化 完整的 DNA雙鏈 （ 3） 連接酶連成完整雙鏈 2. 互補(bǔ)延伸連接法 預(yù)先設(shè)計(jì)的片斷之間有 局部互補(bǔ)區(qū) ，可以相互作為另一個(gè)片斷延長的引物，用 DNA聚合酶 延伸成完整的雙鏈。 （ 2）有些基因比較短，化學(xué)合成費(fèi)用較低 DNA合成儀 5. 合成人工接頭或銜接物 含有各種酶切位點(diǎn) 人工接頭 （ Adaptor）或銜接物 （ Linker）序列。 理論上講，這些重組載體上帶有了該生物體的 全部基因 ，稱為基因文庫。 載體容量越大，所要求的 DNA片斷數(shù)目越少，所需的 重組子 越少。不能用一般的限制性內(nèi)切酶消化法。 ① 物理切割法： 內(nèi)切酶 Sau3A進(jìn)行局部消化。 ② 酶切法： （ 2）載體與基因組 DNA大片段的連接 ① 粘性末端直接連接 載體與外源 DNA大片段的兩個(gè)末端都有相同的粘性末端。 直接連接、人工接頭或同聚物加尾。 各種酶的接頭可以向公司定做或購買。 N= ln (1p) ln (1f) p: 文庫包含了整個(gè)基因組 DNA的概率（ 99%） f: 插入載體的 DNA片斷的平均長度占整個(gè)基因 組 DNA的 百分?jǐn)?shù) N：所需的重組載體數(shù)（克隆數(shù)） 例如：人的基因組是 3 109 bp，插入 DNA片斷的平均長度如果是 104 bp N= ln (1p) ln (1f) = ln (199%) ln (1f) = G f N= G f G： Genome大??； f： fragment大小 N= G f = 3 109 104 = 105 1. cDNA 以 mRNA為模板 逆轉(zhuǎn)錄 出的 DNA稱 cDNA。 （ 1） 不含內(nèi)含子序列 。 （ 3）包含了所有 編碼蛋白質(zhì)的基因 。 4. 構(gòu)建 cDNA文庫的一般步驟 （ 1）總 RNA（ total RNA）提取 3. cDNA文庫的特點(diǎn) 提取總 RNA有商業(yè)化的試劑盒（ kit）。 利用 mRNA都含有一段 polyA尾巴，將 mRNA從總 RNA（ rRNA、 tRNA等）中分離純化。 （ 2） mRNA的分離純化 ① 原理 ② mRNA的分離純化 Column（柱） 反轉(zhuǎn)錄酶 （ 3） cDNA的合成 ① cDNA第一鏈合成 逆轉(zhuǎn)錄酶能以 RNA為模板合成 DNA。 mRNA cDNA 3’ 5’ 5’ AAAAAAA TTTTTTT Ol
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