hxy-第四章-目的基因的獲取(已修改)
2025-05-19 18:09 本頁面
【正文】 第四章 目的基因的獲取 目的基因： 準備要分離、改造、擴增或表達的基因。 基因克隆的本質(zhì)是把某一目的 DNA片段通過無性方式進行擴增和表達，而這一過程往往是通過載體和寄主細胞來實現(xiàn)的。 一般而言，基因克隆包括四部分工作： 目標 DNA片段的獲得； 克隆載體的構建； 寄主細胞的轉(zhuǎn)化； 重組體克隆的選擇和鑒定 。 目前，以大腸桿菌為寄主，以質(zhì)粒和噬菌體等為載體的基因克隆體系已經(jīng)相當?shù)某墒臁? 大腸桿菌作為寄主進行 DNA克隆的實驗方案 DNA片段 的獲得 載體構建 細菌轉(zhuǎn)化 重組體 的鑒定 限制性內(nèi) 切酶消化 機械切割 雙鏈 cDNA 的合成 化學法 直接合成 同聚物 加尾 粘性末端 連接 平末端 連接 加接頭造成 粘性末端 重組噬菌體 DNA轉(zhuǎn)染 重組質(zhì)粒 的轉(zhuǎn)化 體外包裝 進行轉(zhuǎn)導 表型鑒定 核酸雜交 免疫學分析 酶切鑒定 第一節(jié) 基因組 DNA片斷化 一、限制性內(nèi)切酶法 用限制性內(nèi)切酶把基因組 DNA切成不同大小的片斷。 酶切 由于帶有粘性末端，產(chǎn)物可以直接與載體連接。 1. 優(yōu)點 2. 缺點 目的基因 內(nèi)部 也可能有該內(nèi)切酶的切點。目的基因也被切成碎片！ BamH I BamH I BamH I gene 二、隨機片斷化 1. 限制性內(nèi)切酶局部消化法 控制內(nèi)切酶的用量和消化時間，使基因組中的酶切位點只有一部分被隨機切開。 ① 內(nèi)切酶識別位點的堿基數(shù) 影響所切出的產(chǎn)物的長度和隨機程度。 （ 1）限制性內(nèi)切酶的選用原則 1） 4bp的內(nèi)切酶 平均每 46（ 4096） bp一個切點。 2） 6bp的內(nèi)切酶 平均每 44（ 256） bp一個切點。 隨機程度高。如 HaeⅢ 、 AluI、 Sau3A。 ② 內(nèi)切酶粘性末端 能與常用克隆位點相連。 （ Sau3A— BamH I） 2. 機械切割法 （ 1）超聲波 超聲波強烈作用于 DNA，可使其斷裂成約 300bp的隨機片斷。 （ 2）高速攪拌 1500轉(zhuǎn) /分下攪拌 30min，可產(chǎn)生約 8kb的隨機片斷。 1976年 . Khorana提出了用化學方法合成基因的設想，并于 1979年在 science上發(fā)表了率先成功地合成大腸桿菌酪氨酸 tRNA基因的論文。 第二節(jié) 化學合成目的基因 一、目前常用的方法 磷酸二酯法、 磷酸三酯法、 亞磷酸三酯法、 固相合成法 自動化合成法。 化學合成的 DNA片斷一般在 200bp以內(nèi)。 二、 化學合成 DNA片斷的組裝 用 T4多核苷酸激酶 使各個片段的 5’端帶上磷酸。 1. 互補連接法 預先設計合成的片斷之間都有 互補區(qū)域 ，不同片斷之間的互補區(qū)域能形成有 斷點 的完整雙鏈。 （ 2） 5’端磷酸化 （ 1）互補配對 （合成的 DNA單鏈的 5’端是 OH） T
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