hxy-第四章-目的基因的獲取(參考版)
2025-05-10 18:09本頁面
【正文】 目的基因 的引物 1 反轉(zhuǎn)錄成目的基因 cDNA第一鏈 目的基因 的引物 2 目的 基因 cDNA第二鏈 PCR mRNA 。 原核基因組部分 原核細(xì)胞 提取基因組 DNA PCR擴(kuò)增 （ 1）提取基因組 total RNA （ 2）反轉(zhuǎn)錄合成總 cDNA作模板 （ 4） PCR擴(kuò)增 （ 3）根據(jù)目的基因序列設(shè)計(jì)引物 2. 從 mRNA中擴(kuò)增 : RTPCR 原核生物不易得到 mRNA，也不含有polyA尾。 篩選文庫，找到差別基因的全長序列。 （ 5）隨機(jī) 錨定引物 PCR的產(chǎn)物電泳比較 不同組織的 240組引物組合 PCR產(chǎn)物在測序膠中電泳。 引物組合： 240組能分出 20220多條帶！ 實(shí)驗(yàn)結(jié)果： 如果每條帶相當(dāng)于一種 mRNA， 20220 mRNA基本上反映了一種特定細(xì)胞中全部的 mRNA。 AAAAAAAAAAAAAAAA mRNA 3’ 5’ NM TTTTTTTT M： A、 G or C N: A、 G、 T or C 5’ 3’ （ 2） 12種錨定引物 AG TTTTTTTT 5’ 3’ CG TTTTTTTT 5’ 3’ GG TTTTTTTT 5’ 3’ TG TTTTTTTT 5’ 3’ AA TTTTTTTT 5’ 3’ CA TTTTTTTT 5’ 3’ GA TTTTTTTT 5’ 3’ TA TTTTTTTT 5’ 3’ AC TTTTTTTT 5’ 3’ CC TTTTTTTT 5’ 3’ GC TTTTTTTT 5’ 3’ TC TTTTTTTT 5’ 3’ （ 3） 5’端的隨即引物 10 mer AAAAAAAAAAAAAAAA mRNA 3’ 5’ NM TTTTTTTT 5’ 3’ 擴(kuò)增 cDNA第一鏈。 用 羥磷灰石柱 收集單鏈 cDNA，合成為雙鏈DNA進(jìn)行擴(kuò)增、克隆、測序。再同不表達(dá) A蛋白的總 mRNA雜交成 cDNAmRNA雙鏈。 （ Hydroxylapatite column） 從表達(dá) A蛋白 和不表達(dá) A蛋白的組織細(xì)胞中分別提取和分離 總 mRNA。 纖 維 柱 探針 DNA 探針 DNA 探針 DNA 探針 DNA Total mRNA 纖 維 柱 探針 DNA 探針 DNA 探針 DNA 探針 DNA 過柱 與探針堿基互補(bǔ)的 mRNA結(jié)合到柱上，其它 mRNA流走。 文庫 載體 探針 電泳后雜交放射自顯影 測序分析 第四節(jié) 目的基因的分離和擴(kuò)增 一、目的基因的分離 1. 探針柱分離特異 mRNA 根據(jù)已知的基因序列合成探針，結(jié)合到 纖維素柱 上，用來分離純化該基因的 mRNA。 ： 接上人工接頭 粘性末端 CCC CCC 末端轉(zhuǎn)移酶
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