【正文】 據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，因 此而死亡的不下 3000人。 Gene therapy for treatment of severe bined immunodeficiency (SCID), a fatal disorder of the immune system caused by absence of the enzyme adenosine deaminase (ADA) Ashanti DiSilva, the first person to be treated by gene therapy. 第八節(jié) 基因工程生物技術(shù)和社會(huì)倫理問題 由于生物技術(shù)與人類社會(huì)的密切聯(lián)系，所以引起的爭論也十分強(qiáng)烈。 （ 5） ． 將含有正?；虻?T淋巴細(xì)胞回輸?shù)交颊叩墓撬杞M織中。 （ 3） ． 用重組病毒感染體外培養(yǎng)的 T淋巴細(xì)胞 ， 使正常 ADA基因插入到 T淋巴細(xì)胞基因組中 。 1990年 ， 美國第一次對(duì) SCID病人作基因治療 ，其步驟為： （ 1） ． 將正常 ADA基因與反轉(zhuǎn)錄病毒載體相連 ， 構(gòu)建重組病毒表達(dá)載體 。 重癥聯(lián)合免疫缺陷 （ Severe bined immunodeficiency disease， 簡稱 SCID） ， 患者缺乏正常人體免疫功能 ， 其染色體上編碼 腺苷脫氨酶 （ 簡稱 ADA） 的基因發(fā)生突變所致 。 (2)． 將患者的體細(xì)胞 （ 稱靶細(xì)胞 ） 作體外培養(yǎng) ， 常用的有 T淋巴細(xì)胞 ， 骨髓干細(xì)胞 ， 皮膚成纖維細(xì)胞 、 肌細(xì)胞 、 肝細(xì)胞等 (3)． 外源基因的轉(zhuǎn)移 ， 將外源基因通過載體導(dǎo)入到靶細(xì)胞中 ， 常用轉(zhuǎn)染的方法 （ 加入磷酸鈣 ） 導(dǎo)入到細(xì)胞中 ， 并與細(xì)胞中核 DNA整合到一起 ， 也可用重組病毒感染靶細(xì)胞轉(zhuǎn)移外源基因 。 （ 2） ． 生殖細(xì)胞基因治療： 將正常基因?qū)牖颊叩纳臣?xì)胞 、 受精卵或早期胚胎細(xì)胞中， 使這類細(xì)胞中的某些異?；虻墓δ艿靡曰謴?fù) ， 最終發(fā)育成正常個(gè)體 。 □ 基因治療的類別： 根據(jù)基因轉(zhuǎn)移到受體細(xì)胞的不同 ， 可分為體細(xì)胞基因治療和生殖細(xì)胞基因治療 。 遺 傳 疾 病 的 分 類 （一）染色體病 （二）單基因遺傳病 （三）多基因遺傳病 遺傳病的發(fā)病率有增高趨勢 ? 1956年活嬰中有先天性缺陷患兒的比例約 4‰ ； ? 1968年活嬰中有先天性缺陷患兒的比例約 6‰ ； ? 1977年活嬰中有先天性缺陷患兒的比例約 ‰ ； 遺傳病本身具有的嚴(yán)重性 ? 遺傳性 (hereditary): 患者家庭的上、下垂直發(fā)病或同代間的水平發(fā)病， 家系中往往有多個(gè)發(fā)病的個(gè)體； ? 先天性 (inborn): 在胎兒期即存在遺傳損害，生后即出現(xiàn)缺陷，給預(yù)防和治療造成極大的困難； ? 終生性 (life long): 患者受累終生直至死亡 （ AR） （ AR） （ AR） （ AD） （ XR） （線粒體病） 遺傳服務(wù)中應(yīng)遵循的倫理學(xué)原則 遺傳服務(wù)的四大倫理原則 ? 尊 重 自 主 ? 行 善 ? 無 傷 害 ? 公 正 產(chǎn)前診斷中涉及道德問題上的 4項(xiàng)基本準(zhǔn)則 ? 尊重夫婦雙方的選擇 ? 對(duì)個(gè)人和家庭不產(chǎn)生傷害 ? 產(chǎn)前診斷的結(jié)果可靠 ? 產(chǎn)前診斷和遺傳咨詢的自愿性 二、基因治療（ gene therapy） 人類的遺傳性疾病治療的常規(guī)方法： （ 1） 手術(shù)治療 ， 如先天性心臟病通過手術(shù)加以矯正 .（ 2）藥物治療 ， 如生長激素缺乏癥 （ 侏儒 ） 可注射人生長激素等 。 （ 4） ． 對(duì)芯片上的熒光作掃描和分析 。 （ 2）．從被測對(duì)象的細(xì)胞中提取 DNA，用酶切成較小的片段，并對(duì) DNA作熒光標(biāo)記，并熔解成單鏈。該技術(shù)可用于大規(guī)模篩查由基因突變引起的疾病。 4. 基因芯片技術(shù) （ DNA microarrays or DNA chips) □ 概念： 基因芯片技術(shù)是 DNA雜交探針與半導(dǎo)體工業(yè)技術(shù)相結(jié)合的產(chǎn)物。 每一周期可使目的基因擴(kuò)增一倍 ， 經(jīng) 30個(gè)周期可擴(kuò)增 230目的基因片段 。 （ 2） 退火 ， 將反應(yīng)系統(tǒng)降至 55℃ ， 使引物能與模板單鏈 DNA的特定部位配對(duì)結(jié)合 。再對(duì)擴(kuò)增樣品作酶切和電泳，其結(jié)果可直接從電泳圖獲得：該法簡便，只需微量細(xì)胞就可作出診斷。 Genotype determination using allelespecific oligonucleotides (ASOs). 197 3. PCR檢測法 用 Southern雜交法對(duì)鐮形細(xì)胞貧血癥作產(chǎn)前診斷需要足夠的細(xì)胞， 并需提取純化 DNA， 并作酶切和雜交等步驟 ， 不但所需時(shí)間較長 ， 而且有一定的風(fēng)險(xiǎn) 。 因?yàn)橐吧秃屯蛔冃椭徊钜粋€(gè)核苷酸 ， 都可能與正常野生型探針雜交 。 突變攜帶者 （ 雜合子 ） ， 其 β珠蛋白等位基因中 ， 一個(gè)是正常的基因 ， 它有 3個(gè)切點(diǎn) ， 切成 2個(gè)片段；另一個(gè)攜帶突變的基因片段中只有 2個(gè)切點(diǎn) ， 產(chǎn)生一個(gè)大的片段 。 下圖為正常和異常蛋白 、 基因和內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)變化圖 。 正常紅細(xì)胞 鐮形紅細(xì)胞 （ 2） 檢測原理： 由于血紅蛋白基因上單個(gè)核苷酸的替換 （ A→T） ，使該部位的正常序列由 CCTGAGG變成 CCTGTGG， 從而使患者 DNA中消失了一個(gè)可被特定內(nèi)切酶 （ Mst II） 切割的切點(diǎn) 。 □ 人類遺傳性 疾病的產(chǎn)前診斷 人類有 200多種遺傳病可用基因診斷技術(shù)作出準(zhǔn)確的診斷，甚至在發(fā)病前和出生前作出診斷。 第七節(jié) 遺傳病 ——基因診斷 和基因治療 一、基因診斷 □ 感染性疾病的診斷： 人類感染了外源的病毒、細(xì)菌等引起的傳染性疾病的診斷可以直接分析患者的組織、器官或血液等來確定是否有外來病源性生物的基因。供體細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間越長， TRF越短 . □ 動(dòng)物克隆的危險(xiǎn)性： 1． 克隆動(dòng)物已出現(xiàn)廣泛的免疫缺陷或早期夭亡 。 是全世界注目的焦點(diǎn) ， 有人設(shè)計(jì)了克隆人的技術(shù)路線 動(dòng)物克隆中急待解決的問題 低 (13%) 化是影響克隆胚胎發(fā)育的重要因素 . : 發(fā)現(xiàn)有些克隆動(dòng)物的線粒體 (mtDNA)為雜合體 ,既有受體胞質(zhì)的 ,也有供體細(xì)胞來的 . ： 正常細(xì)胞沒有端粒酶，所以端粒會(huì)隨著細(xì)胞分裂而變短，細(xì)胞衰老。 轉(zhuǎn)基因體細(xì)胞克隆技術(shù)比轉(zhuǎn)基因動(dòng)物（通過原核注射）的方法優(yōu)越：后者整合率和表達(dá)率低，經(jīng)常出現(xiàn)嵌合體。 由于體細(xì)胞包含有全部的遺傳信息， 可以從體細(xì)胞獲得完整的動(dòng)物個(gè)體 。 體細(xì)胞克隆可達(dá)到親代個(gè)體的自我復(fù)制。 4. 以后長期用較晚期胚胎細(xì)胞和體細(xì)胞核移植一直失敗 ， 產(chǎn)生了一種觀點(diǎn)：用高度分化的動(dòng)物體細(xì)胞進(jìn)行克隆在生物學(xué)上是不可能的 ? 5. Wilmut， 1997年 ， 用綿羊乳腺細(xì)胞核移植 ，實(shí)現(xiàn)了在去核卵細(xì)胞中重新編程（ Reprogramming） ， 開創(chuàng)了高等動(dòng)物體細(xì)胞克隆新時(shí)期 。 1962年 Gurdon 用成年蛙體細(xì)胞克隆出青蛙， 1965年童第周完成了金魚的核移植成功。 動(dòng)物細(xì)胞的全能性？ 長期認(rèn)為在動(dòng)物發(fā)育的早期胚胎階段，每個(gè)胚胎細(xì)胞都具有全能性，但是隨著胚胎發(fā)育，胚胎細(xì)胞逐漸失去了這種全能性而開始功能分化，有的發(fā)育成神經(jīng)組織，有的發(fā)育成肌肉組織。 2. Guha， 1964， 曼陀羅花藥培養(yǎng)成單倍體植株 。 例如植物體的每個(gè)細(xì)胞都具有在離體條件下誘導(dǎo)分化形成完整植株的能力 ， 這是由于每個(gè)細(xì)胞都具有完整基因組實(shí)現(xiàn)的 。 根據(jù)細(xì)胞理論 ， 提出高等植物器官和組織可以不斷分割直至單個(gè)細(xì)胞的觀點(diǎn) 。 要突破生物有性繁殖和無性繁殖的界限應(yīng)該從它們的共性出發(fā)，從操作細(xì)胞開始。名詞 clone意指無性繁殖（系），作為動(dòng)詞意指產(chǎn)生無性繁殖系的過程，所以 clone 可以稱為無性繁殖或復(fù)制 現(xiàn)在的克隆技術(shù)可分為三個(gè)層次：基因、細(xì)胞、個(gè)體。 治療遺傳病 去除多余基因或修飾改造原有異?；蛞赃_(dá)到治療的目的 . 五 . 動(dòng)物克隆技術(shù) 克隆的基本概念 克隆是英文 clone的譯音，最早來自希臘字 clonos，意指樹枝條。 基因敲除的應(yīng)用領(lǐng)域主要有： 建立人類疾病的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型 基因敲除小鼠是研究疾病的發(fā)生機(jī)理、分子基礎(chǔ)及診斷治療的重要實(shí)驗(yàn)材料。 基因敲除還包括引入新基因及引入定點(diǎn)突變。 基因敲除（ gene knock out） 是指對(duì)一個(gè)結(jié)構(gòu)已知但功能未知的基因，從分子水平上將該基因去除，然后從整體觀察實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，推測相應(yīng)基因的功能。 由于人和老鼠的基因非常接近，因此當(dāng)懷疑人類基因圖譜中的某一片段同某種疾病相關(guān)時(shí)，就將老鼠體內(nèi)的這個(gè)基因去除掉，看它會(huì)長成什么樣。所以， 通過培育缺陷性狀得到矯正的動(dòng)物 (或細(xì)胞 ) 可以為這類疾病的基因治療提供動(dòng)物 (或細(xì)胞 )模型。 轉(zhuǎn)基因的方法 : 按基因?qū)敕绞絼澐?,建立轉(zhuǎn)基因動(dòng)物主要有： 顯微注射法 , 反轉(zhuǎn)錄病毒感染法 胚胎干細(xì)胞法 . 顯微注射與反轉(zhuǎn)錄病毒感染方法都是把 DNA直接導(dǎo)入受精卵或在不同的發(fā)育階段 . 受精卵 四細(xì)胞胚胎 囊胚 原腸胚 轉(zhuǎn)基因動(dòng)物 顯微注射 反轉(zhuǎn)錄病毒感染 DNA DNA 在受精卵不同發(fā)育階段的轉(zhuǎn)基因方法 轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的應(yīng)用 研究遺傳疾病的基因治療 人類倫理道德一般不允許直接對(duì)人的受精卵進(jìn)行基因操作，一般是將處理過的體細(xì)胞移植到患者體內(nèi)。使轉(zhuǎn)基因動(dòng)物象一個(gè)活的發(fā)酵罐一樣來生產(chǎn)目的基因的產(chǎn)物。 (2).改變動(dòng)物基因型使其表型更符合人類需要 。 5． 轉(zhuǎn)基因植株的遺傳 以孟德爾比例傳遞 。只需用乙烯處理后即可成熟供應(yīng)市場 。將這種酶的基因分離出來，再根據(jù)該基因序列結(jié)構(gòu)合成它的互補(bǔ)基因，再將這種互補(bǔ)基因轉(zhuǎn)入到西紅柿植株中，它將會(huì)產(chǎn)生出一種與上述蛋白酶基因正常轉(zhuǎn)錄的 mRNA相互補(bǔ)的 mRNA（ 稱反義 RNA），并且與之結(jié)合成雙鏈，使之不能正常翻譯成催化西紅柿成熟的蛋白酶。 葉片用抗乙肝病毒表面抗原的抗體處理的結(jié)果。 草甘膦能被植物細(xì)胞的葉綠體的酶（EPSP合成酶 ）所分解，該酶對(duì)細(xì)菌和植物中的氨基酸的合成很重要，沒有這種酶的作用，植物就會(huì)干枯和死亡。通過感染轉(zhuǎn)化植物組織和細(xì)胞，并使之培養(yǎng)成完整的植株。 Ti質(zhì)粒上的一段 DNA能轉(zhuǎn)移到侵染的植物部位細(xì)胞中，并插入到植物染色體中，由于該片段（稱 TDNA）上具有誘發(fā)腫瘤的基因，所以能誘發(fā)植物產(chǎn)生腫瘤。 1. 冠癭瘤 ——天然的植物基因工程 自然界某些植物受到農(nóng)桿菌的侵染會(huì)形成腫瘤 ——冠癭瘤。 與野生型病毒共轉(zhuǎn)染培養(yǎng)的昆蟲細(xì)胞 用磷酸鈣沉淀法將重組轉(zhuǎn)移載體質(zhì)粒pVL1393hGH與野生型病毒 AcMNPV DNA共轉(zhuǎn)染貼壁培養(yǎng)狀態(tài)良好的 Sf9細(xì)胞，由于pVL1393多角體啟動(dòng)子兩側(cè)存在與多角體基因同源序列，可與野生型病毒基因發(fā)生同源重組，從而使人生長激素基因替代野生型病毒中的多角體蛋白基因，得到重組病毒 rAcVhGH 。 由此經(jīng)過幾輪的空斑純化即可獲得多角體缺陷的重組病毒 。 重組后由于多角體蛋白基因已被外源基因所取代 ， 只能產(chǎn)生無多角體的空斑（ occ） 。通過重組病毒空斑純化得到能表達(dá)外源基因的重組病毒。 由于這兩個(gè)特點(diǎn) ， 使人們得以設(shè)計(jì)利用桿狀病毒啟動(dòng)子在昆蟲細(xì)胞中表達(dá)外源基因 . 桿狀病毒表達(dá)載體構(gòu)建 由于 AcMNPV基因組的巨大 ， 不可能用單一的限制性酶來對(duì)它進(jìn)行操作 ， 所以目前使用的桿狀病毒表達(dá)載體系統(tǒng)大多采用構(gòu)建轉(zhuǎn)移載體 （ transfer vector）的方法 。 如 Fig所示 。 多角體包含體的組成 ?桿狀病毒基因表達(dá)的級(jí)聯(lián)式時(shí)序調(diào)控 桿狀病毒的基因表達(dá)分為 4個(gè)時(shí)期：極早期（ immediateearly, α） 、 晚早期 (delayedearly,β)、晚期 (late, γ)和極晚期 (very late, δ)。 3. 在感染后 12h采用出芽方式離開宿主細(xì)胞，在跨過宿主細(xì)胞的質(zhì)膜時(shí)，以宿主的質(zhì)膜形成