【正文】 5, AAA AAAA 5, 3, 5, 3, AAA AAAA TT TTT TT TT AAAA AAAAA T TT TT TT TT 5, 3, 3, 5, 5, 3, 3, 5, 5, 3, 5, 3, E coRI 外切酶 末端轉移酶 dATP shear 外切酶 末端轉移酶 dTTP TTTT TTTTT Plasmid DNA Drosophila DNA DNA polymerase,DNA ligase 末端轉移酶（terminal transferase）能催化 DNA的 3’末端加上核苷酸尾，如將 dA和 dT加到不同的 DNA末端，就可以連接成重組質粒 2． 人工接頭的應用 人工接頭是一個合成的含有特定限制酶識別順序的核苷酸片段。 （ 2） 分子中具有一個復制起始點 ， 能使載體自身和插入的外源 DNA共同復制 。 (4) 比較容易從宿主細胞中回收 1． 質粒 ： 雙鏈環(huán)狀 DNA分子 ， 能經(jīng)轉化導入 優(yōu)點：能使宿主細胞產(chǎn)生抗性 ， 便于選擇質粒， 在細胞中的拷貝數(shù)多 。 Lac Z基因編碼β半乳糖苷酶的一個亞基，它可以使攜帶載體的細菌在含有 Xgal（能被 β半乳糖苷酶水解的底物）的培養(yǎng)界上形成 藍色的菌落。 挑選出白色菌落可作進一步鑒定。再用探針與菌落中的 DNA進行雜交，可從許多未知的菌落中挑選出克隆有目的基因的菌落。 3． 單鏈病毒 在感染 ， 感染性單鏈能轉變?yōu)殡p鏈的復制型 。 這種噬菌體用作克隆的優(yōu)點：在重新感染合適的宿主時 ， 它產(chǎn)生的噬菌體顆粒是單鏈 DNA，為 DNA序列分析提供方便 。 某些載體質粒既具有 ， 又具有動物病毒 SV40的復制起點 ， 這樣的質粒既可在 ， 又可在培養(yǎng)的動物細胞中復制， 應此稱為穿梭載體 。 非選擇性地在細菌中克隆一個高等生物的隨機 DNA片段的方法稱為鳥槍法 （ Shotgunning） ，全部克隆的集合體稱為一個基因文庫 （ gene bank, or gene library） 。 2 ．用一目的基因的一個探針從整個 DNA酶切片段的集合體中選出合適的酶切片段，然后再克隆特定的片段。 二、鑒定克隆的基因 1．用特定的內切酶消化重組質粒，電泳比較切出片段的大小。 Southern發(fā)明了一種對電泳凝膠中的 DNA作分子雜交鑒定的方法。 單鏈 DNA能結合到硝酸纖維濾膜上，酶切物經(jīng)電泳后，瓊脂糖膠作變性處理，然后將 DNA吸印到膜上，用 32P標記的 DNA或 RNA探針與膜上的 DNA作雜交，自顯影后可顯示出目的基因的位置和大小。 用反轉譯酶從 mRNA制備 cDNA， 全部 cDNA片段與質粒載體相連 ， 轉化 cDNA文庫 。 用反轉錄酶從 mRNA合成 cDNA；全部 cDNA片段與載體相連并轉入細菌細胞獲得的全部克隆稱 cDNA 文庫 ， 再從cDNA文庫中調出目的cDNA克隆 。例舉兩種鑒定該基因的具體方法，要求寫出實驗步驟，并且用圖表示鑒定結果。在 重組 DNA 技術中常需研究 DNA 序列上特定部位的功能，或改變 基因編碼區(qū)個別氨基酸的密碼子以提高該基因表達蛋白質活性 等。在聚合酶作用下，合成一條互補的含有突變基因的鏈，將雜合雙鏈引入大腸桿菌細胞，經(jīng)復制后會產(chǎn)生一個野生型和一個突變型基因的細胞，再用分子雜交法作鑒定。 1977年 Sanger發(fā)明了以雙脫氧核苷三磷酸 （ 2’3’ddNTPs） 作為 DNA合成終止劑的 “ 末端終止法 ” ， 開創(chuàng)了基因核苷酸序列測定的先河 ， 最早完成了 Φ 174全部序列的測定 。 發(fā)現(xiàn)了重疊基因 Sanger等最早對 Φ 174病毒作 DNA序列分析 ， 該病毒基因組全長 5400bp， 共編碼 9種蛋白質 ， 但根據(jù)該 9種蛋白質分子量推算其編碼區(qū) ， 明顯超過病毒基因組5400bp長的核苷酸所能編碼的容量 。 Φ 174病毒的重疊基因如下： A B C D J F G H E 重疊基因概念與密碼子的非重疊性 Sanger采用獨創(chuàng)的序列分析方法對 Φ 174病毒基因組作序列分析，提出了令世人驚訝的重疊基因概念，是對基因認識的重大發(fā)展。 如下圖： aa1 aa2 3 59 60 61 62 63 149 150 151 152 ↑ ATG AGT CAA …… GTT TAT GGT ACG CTG ……GAA GGA GTG ATG TAA 175 189 445 aa1 aa2 3 4 89 90 ↓ 基因 E開始 基因 E終止 ↑ 基因 D開始 基因 D終止 Sanger序列分析方法原理 采用單鏈 DNA（ 或將含有外源基因的重組質粒 DNA變性 ） ， 在引物和 DNA聚合酶的作用下 ， 在四組獨立的反應中除加有 4種 dNTPs外 （ 其中之一為同位素標記 ） ， 再分別加入 4種 ddNTPs中的一種作為鏈延伸的終止劑 ， 結果將在四組反應管中產(chǎn)生長度不等的 4組寡核苷酸鏈 ， 它們分別終止于被測鏈的每一個 A、 G、 C或 T。 O Base H H O = P – P – P – O O O O O O O 2’、 3’ddNTP的結構，注意其 3’位置是一個 H而不是 OH，因此后續(xù)的脫氧核苷酸不能接到 3’位上 從 而造成鏈的終止。 第六節(jié) 基因工程 由基因工程方法產(chǎn)生的生物稱為轉基因生物 ， 它一般是指由導入外源 DNA的細胞發(fā)育而成的生物 。 一、利用微生物基因工程生產(chǎn)重組基因工程藥物 利用基因工程技術不但能得到大量的具有特殊功能的基因。 （ 2）具有生物活性的蛋白和多肽是珍稀而具有很高醫(yī)療價值的藥物，用常規(guī)分離的方法很難制取。 人類最早的商業(yè)化基因工程藥物是 人胰島素和人生長激素， 于 80年代初投放市場 ， 用大腸桿菌來生產(chǎn) ， 是 基因工程 發(fā)展的里程碑 。 □ 人生長激素是治療侏儒癥 ， 青少年增高和促進創(chuàng)傷組織修復的藥物 ， 生長激素具有種屬特異性 ， 從動物腦組織來源的生長激素不能用于人類 ， 之前只能從剛死亡的人大腦垂體中分離純化 ， 來源極有限；而且發(fā)現(xiàn)長期應用會對人類有毒副作用 。目前國內外大多采用生化提取的方法從人肝臟組織中分離 F抗原 ， 由于難以得到 F抗原純品 ， 給大量制備診斷試劑帶來困難 。 方法： 基因克隆。將酶切結果正確的表達質粒命名為pET15bF。且在該表達系統(tǒng)中得到高表達， 外源蛋白表達量約占全菌總蛋白的 40%。 表達產(chǎn)物的 Westernblot鑒定結果顯示：該表達蛋白可與豚鼠抗人 F 蛋白的抗血清發(fā)生特異性結合反應 ， 在硝酸纖維素膜上呈現(xiàn)一條分子量為 43kD的顯色帶 （ ） SDSPAGE and Westernblot of the expressed F Antigen (A) molecular weight standard。 body of the lysate。 noninduced by IPTG。 induced by IPTG。 因此用真核細胞表達和生產(chǎn)基因工程藥物已受到重視 。 幾種重要的基因工程藥物已可用真核細胞反應器完成 治療癌癥抗病毒 預防病毒性肝炎 治療血友病 治療貧血癥 治療心臟病 促生長，增強免疫功能 酵母菌 酵母菌 哺乳動物細胞 哺乳動物細胞 哺乳動物細胞 昆蟲細胞 α干擾素 乙肝疫苗 集落刺激因子 紅細胞生成素 組織溶纖酶原激活劑 人生長激素 應 用 細 胞 名 稱 昆蟲細胞桿狀病毒表達系統(tǒng) (Insect cell and Baculovirus Expression System) 是一種高效的真核細胞表達系統(tǒng) 桿狀病毒因其病毒粒子呈棒狀或桿狀而得名。 1. 幼蟲吞食了感染有多角體的食物 ,多角體在消化道的堿性環(huán)境下溶解，釋放出病毒顆粒， 2. 每個病毒顆粒的脂蛋白外被又與腸壁細胞的質膜相融合，最終將核殼體釋放至胞質中，核殼體再將自己的 DNA轉入細胞核內。幾個病毒顆粒聚集成一簇，嵌在晶狀基質中成為一個多角體包含體。 通常 ， 每一后續(xù)時期基因的表達水平都高于前一時期基因表達的水平 ， 其中極晚期基因表達水平顯著提高 ， 這也是構建桿狀病毒表達載體的基礎 。 Fig Schematic representation of the four phases of baculovirus gene expression in vitro 多角體蛋白 P10蛋白 由于 多角體蛋白基因及 P10蛋白基因具有非常高效的啟動子 ， 同時由于 這兩個基因的產(chǎn)物不參與感染病毒顆粒的形成 ， 可以從病毒基因組中去除而不會對病毒的復制及感染造成影響 。 將帶有外源基因的轉移載體 DNA和野生型病毒 DNA共轉染體外培養(yǎng)的昆蟲細胞，使得轉移載體與野生型病毒發(fā)生同源重組，外源基因取代多角體基因， 如 Fig所示。 Transfer vecter Pp Cloned gene Pt 5, 3, Polyhedrin gene AcMNPV DNA Rebinant AcMNPV Fig. 共轉染發(fā)生同源重組獲得重組病毒 野生型病毒感染的昆蟲細胞由于存在多角體基因 ， 空斑測定時產(chǎn)生有多角體的空斑（ occ+） 。 在光學顯微鏡下根據(jù)折光率的不同可區(qū)分這兩種不同表型的空斑 。 用重組病毒感染宿主細胞 ， 感染后期得到外源基因的高效表達 。 重組病毒的 Southern 雜交鑒定 ， hGH cDNA整合 進桿狀病毒基因組的正確位置中 表達產(chǎn)物的 SDSPAGE與 Westernblot分析 三、植物基因工程 □ 定義： 將外源目的基因導入體外培養(yǎng)的植物組織或細胞，通過組織或細胞培養(yǎng)使之發(fā)育成完整的再生植株 ——轉基因植株。其形成的機理是由于 農桿菌 中含有的一種誘發(fā)腫瘤的質粒所引起的，稱為 Ti質粒（ tumorinducing plasmid，簡稱 Ti質粒）。 TDNA Tumor production Nopaline synthesis TDNA transfer function Nopaline utilization Origin of replication Ti plasmid Ti質粒（胭脂堿型）簡圖 冠癭瘤 ——天然的植物基因工程 2. 農桿菌 Ti質粒作為植物基因工程載體 科學家根據(jù)冠癭瘤形成的分子機理，通過改建農桿菌 Ti質粒，使 Ti質粒中的致瘤基因失活，同時插入目的基因，使之成為基因工程載體。 Cointegrate Tiplasmid Tobacco plant cell Trasformed cell Cultured cell Plantlet Transgenic tobacco plant Cell of transgenic plant 植物基因工程 程序圖 3. 抗除草劑基因工程 (Gene transfer of glyphosate resistance) 草甘膦在低濃度時非常有效，對人無毒，可被土壤中微生物分解。 從抗草甘膦的細菌中分離和克隆 EPSP合成酶的基因和抗除草劑基因工程 抗除草劑基因工程示意圖 首先從抗草甘膦的細菌中分離和克隆EPSP合成酶基因，再進行植物抗除草劑基因工程 Gene transfer of glyphosate resistance Tobacco leaves expressing the hepatitis B antigen. 轉基因植物葉片表達乙肝病毒表面抗原。 正常 葉片 4. 具有易于長期保鮮的轉基因西紅柿的制作過程原理如下： 通常的西紅柿不易保存保鮮