【正文】 末端轉(zhuǎn)移酶 （ terminal transferase） 能催化 DNA的 3’末端加上核苷酸尾 ， 如將 dA和 dT加到不同的 DNA末端 ， 就可以連接成重組質(zhì)粒 ， polyG和 polyC也可用相同方法加尾 。 非選擇性地在細(xì)菌細(xì)胞中克隆某一生物的隨機(jī) DNA片段的過(guò)程稱鳥槍法 ，全部克隆集合體稱某一生物的 基因文庫(kù) 。 細(xì)胞內(nèi)總 DNA的提取和基因文庫(kù)的構(gòu)建 各種生物的特定組織 （ 如血液 、 肝臟 、 植物組織 、 細(xì)菌細(xì)胞等 ）都含有大分子量的 DNA。 （ 2） 以 mRNA為模板反轉(zhuǎn)錄合成互補(bǔ)的 DNA， 稱 cDNA， 并構(gòu)建 cDNA克隆 。 一般意義上的重組DNA技術(shù)專指在細(xì)菌細(xì)胞中特異性地?cái)U(kuò)增特定 DNA片段的分子克隆技術(shù)，廣義上的重組 DNA技術(shù)還延伸到整個(gè)基因工程的應(yīng)用領(lǐng)域 。 （ 4） 對(duì)轉(zhuǎn)化子 （ 含有重組分子的受體細(xì)胞 ） 進(jìn)行篩選和鑒定， 以確認(rèn)含有外源基因 。 重組 DNA技術(shù)的基本步驟 （ 1） 獲得目的基因 ， 一般是有重要生物學(xué)功能的外源基因 。 要求標(biāo)出 EcoRI、 HindⅢ 和 BamHI的位點(diǎn)和它們間的距離 。如用上述兩酶混合消化獲得 、 。 1 1 2 2 3 3 4 4 5 5 D A E B F C 1 2 3 4 5 2 1 2 1 酶切位點(diǎn) 2 1 2 1 酶切圖譜 練習(xí)題： 從某一生物的基因組 Bam HI文庫(kù)中獲得了長(zhǎng) ,如用 EcoRI消化該片斷獲得 、 。 2． 方法要點(diǎn)：特定來(lái)源的 DNA經(jīng)不同的酶消化后 ， 樣品經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳分離 ， 可得到限制位點(diǎn)的圖譜 。 從正向和反向閱讀是同一句子： ABLE WAS I ERE I SAW ELBA 幾種限制酶的名稱和識(shí)別序列 T↓C T A G A A G A T C↑T Xba I C T G C A↓G G↑A C G T C Pst I A↓A G C T T T T C G A↑A Hind III G A T↓A T C C T A↑ T A G EcoR V G↓A A T T C C T T A A↑G EcoR I G↓G A T C C C C T A G↑G Bam H I 識(shí)別位點(diǎn)序列 內(nèi)切酶 四 、 限制酶作圖 1． 在 DNA分子上確定限制酶切點(diǎn)的相對(duì)順序是一種重要的染色體作圖法 。 上述序列中腺嘌呤的甲基化也能保護(hù) DNA免受 EcoRI的切割 。 5’－ G－ A－ A－ T－ T－ C－ 3’ 3’－ C－ T－ T－ A－ A－ G－ 5’ 上述序列是旋轉(zhuǎn)對(duì)稱的 。 ?在宿主限制現(xiàn)象中有兩個(gè)相互的過(guò)程： （ 1） 由于宿主核酸酶的作用破壞了侵入的噬菌體 DNA， 從而 限制 了噬菌體的繁殖； （ 2） 噬菌體 DNA修飾 免除了限制酶的作用 。 ☆ 怎樣保護(hù)宿主自身的 DNA和感染性 X－ A噬菌體 DNA免受宿主核酸酶的攻擊 ？ 有一種酶能在特定序列上修飾特異性堿基 ， 但是并不改變這些堿基的編碼性質(zhì) 。細(xì)菌的基因型決定該細(xì)菌對(duì)各種噬菌體感染的敏感性， 一種噬菌體的基因型決定它所能感染細(xì)菌的范圍 ，它們之間具有密切的依賴和限止關(guān)系 。 a b c d e a, b, c, d, e, a b d e a, b, d, e, a b c d e a, b, c, d, e, a b d e a, b, d, e, a b c d e a, b, d, e, Heat Mix and cool 三 、 染色體上 DNA序列的定位 用特異性 RNA或 DNA作探針與染色體上相應(yīng)的 DNA互補(bǔ)區(qū)域作雜交 ， 從而確定該特異性基 因 的 位 置 稱 染 色 體 原 位 雜 交 （ in situ hybridization of chromosome） 。用 S1核酸酶處理，消除單鏈。 組蛋白是與核 DNA結(jié)合的堿性蛋白 ， 富含精氨酸 ， 其編碼區(qū)相對(duì)富含 G－ C對(duì) 。第四章 基因操作 Gene manipulation 第一節(jié) 堿基互補(bǔ)的能力 一 、 DNA的熱變性 1． G－ C含量高的 DNA具有較高的熔解溫度 ， 可以根據(jù)熔解溫度的不同將 GC含量不同的 DNA分子分開(kāi) ， 并可推測(cè) DNA分子中 G－ C的相對(duì)含量 。 2． 根據(jù)熔解溫度的差別在 DNA分子中作基因定位和分離基因 。 海膽組蛋白基因在較底溫度時(shí)（ 61℃ ）的變性電鏡圖，每種組蛋白基因被一個(gè)富含 A－ T對(duì)區(qū)域間隔開(kāi)。 H1 H2A H3 H2B H4 二 、 互補(bǔ)單鏈的復(fù)性 利用互補(bǔ)單鏈復(fù)性的特點(diǎn)可以確定基因缺失的位置和大?。阂粋€(gè)缺失突變體的 DNA和一個(gè)野生型的 DNA一起復(fù)性后就可確定缺失區(qū) 。 In situ hybridization of human metaphase chromosomes using fluorescent technique (FISH) 第二節(jié) 限制性內(nèi)切酶 一 、 宿主限制現(xiàn)象 X X A B XA XB A B A B XA XB XA XB 100% 100% % 100% Phage Infect Bacteria 從兩個(gè)不同菌株 A和 B來(lái)的噬菌體 X具有不同的感染能力 XA A XA B XB A XA 100% 100% 很差 無(wú)法分離到能感染 A細(xì)菌的 XB來(lái)的噬菌體 用很少一些感染力差的 結(jié)果說(shuō)明： 噬菌體的宿主范圍取決于它所來(lái)源的細(xì)菌菌株 ， 而不是噬菌體的基因型； 宿主的基因型對(duì)噬菌體有一種修飾作用 ， 但并不改變噬菌體 DNA的序列 。 在不同基因型的細(xì)菌中生長(zhǎng)的噬菌體其具有不同的感染能力 二 、 DNA的修飾 ☆ 是什么限制了 X－ B噬菌體在菌株 A中的繁殖呢 ？ 是由于宿主的一種核酸酶的作用 ， 它能將噬菌體DNA切成許多無(wú)感染力的片段 ， 宿主細(xì)胞具有破壞其陌生 DNA的防衛(wèi)系統(tǒng) 。 如在胞嘧啶和腺嘌呤上增加一個(gè)甲基后就能保護(hù) DNA免受核酸酶的攻擊 ， 該過(guò)程稱 甲基化作用 （ methylation） 。 Bacterium A has the capacity to modify DNA whereas B does not 三 、 限制酶的特異性 1970年 ， Hamilton Smith從流感嗜血桿菌 d株分離到能識(shí)別特定核苷酸序列 ， 切點(diǎn)專一的限制酶－ HindII ↓ 5’－ G－ T－ Py－ Pu－ A－ C－ 3’ 3’－ C－ A－ Pu－ Py－ T－ G－ 5’ ↑ Smith進(jìn)一步證明宿主誘導(dǎo)的甲基化作用保護(hù)了具有同樣序列的 DNA免受 HindII的切割： ↓ m 5’－ G－ T－ Py－ Pu－ A－ C－ 3’ 3’－ C－ A－ Pu－ Py－ T－ G－ 5’ m ↑ * * Py： pyrimidine Pu： purine R質(zhì)粒的一個(gè)基因產(chǎn)生的限制酶 EcoRI， 它對(duì) SV40病毒的環(huán)狀 DNA分子上只有一個(gè)切點(diǎn) 。 由于切點(diǎn)是錯(cuò)開(kāi)的 ， 因此使 SV40的環(huán)狀分子切開(kāi)成具有 粘性末端 （ sticky ends） 的線狀分子 。 m m 回文序列 —palindrome ↓ 5’…… G A A T T C …… 3’ 3’…… C T T A A G …… 5’ ↑ EcoRI切點(diǎn)的兩條鏈中的序列從相反方向閱讀是一樣的 ， 稱為回文序列 —palindrome。 從圖上任何兩個(gè)切點(diǎn)之間的距離可估計(jì)出核苷酸的數(shù)目 。 1 2 3 4 5 5, 3, 3, 5, 酶 1 酶 2 1 2 3 4 5 32P 32P 酶 1 酶 2 Digestion 1 2 3 4 5 32P 1 2 3 4 5 32P 32P A B C D E F (a) (b) 32P 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 酶 2 A B C 1 2 3 4 5 D E F 1 2 4 5 酶 1 (a) (b) 根據(jù)重疊的亞片段排列原先片段的順序 亞片段 位于原先片段 1 2 3 4 5 A D A E B E B F C F (c) 3 根據(jù)重疊的亞片段排列原先片段的順序 ， 可以得到一個(gè) DNA的酶切圖譜 。如用 Hind Ⅲ 消化獲得 和 。 根據(jù)上述結(jié)果繪制限制性圖譜 。 第三節(jié) 重組 DNA ? 在細(xì)菌細(xì)胞中選擇性地?cái)U(kuò)增特定DNA 片 段 的 過(guò) 程 稱 分 子 克 ?。?molecular cloning） 。 （ 2） 在限制性內(nèi)切酶和連接酶的作用下 ， 將目的基因與克隆載體相連接 ， 組成一個(gè)新的重組 DNA分子 （ rebinant DNA （ 3） 將重組 DNA分子引入受體細(xì)胞 ， 并在細(xì)胞中進(jìn)行 DNA復(fù)制 ， 最常用的受體細(xì)胞為大腸桿菌 。 大量培養(yǎng)細(xì)胞可獲得目的基因的大量拷貝，或基因表達(dá)的產(chǎn)物等。 重組 DNA技術(shù)的基本步驟 外源DNA 載體 重組 目的基因的制備 構(gòu)建重組 DNA分子 ， 首先要獲得有用的目的基因片段 ，最常用的方法有三種： （ 1） 直接從一生物中提取基因組 DNA， 并構(gòu)建該基因組的文庫(kù) （ gene library） 再?gòu)闹姓{(diào)出目的基因的克隆 。 （ 3） 采用聚合酶鏈反應(yīng) （ PCR） 特異性地?cái)U(kuò)增某一目的基因的片段 。 由于目的基因位于整個(gè)基因組 DNA中 ，難以檢出和分離 ， 可以先將基因組 DNA用內(nèi)切酶切成較小的片段， 再將它們分別與載體相連 ， 并轉(zhuǎn)入細(xì)菌細(xì)胞中進(jìn)行繁殖和擴(kuò)增， 再對(duì)各個(gè)不同的克隆作出檢定 。組成一個(gè)生物的基因文庫(kù)的全部重組質(zhì)粒或重組噬菌體中的目的基因就代表了一個(gè)生物的整個(gè)基因組。 同聚物加尾連接的優(yōu)點(diǎn)：加尾后 DNA片段自身不會(huì)環(huán)化 ，可提高異源 DNA重組率 。 TTAA AATT 5, 3, 3, 5, 5, 3, 3,