【正文】 自己的外被，形成表型為 出芽型病毒粒子（ budded virus, BV） ， 生活史 Polyhedrin Protein Virion Envolope Nucleocapsid crosssection Nucleocapsid Longitudinalsection Polyhedron envelope DNA蛋白復(fù)合體由 39KD衣殼蛋白外被所包圍，形成一個(gè)核衣殼，若干個(gè)核衣殼外面再包被一層脂蛋白外被就成為病毒顆粒。 苜蓿尺蠖核型多角體病毒 (Autographa californica multiple nuclear polyhedrosis virus， AcMNPV)作為桿狀病毒 昆蟲細(xì)胞真核基因表達(dá)系統(tǒng)的載體被廣泛應(yīng)用。 □ 真核細(xì)胞反應(yīng)器： 外源基因在合適的載體帶動(dòng)下轉(zhuǎn)染進(jìn)入體外培養(yǎng)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞 ， 昆蟲細(xì)胞或酵母細(xì)胞 ， 通過大規(guī)模培養(yǎng)細(xì)胞表達(dá)外源基因 。 target protein (B) Westernblot of the purified target protein. Guinea pig polyclonal antiserum against human F antigen was used as primary antibody. (A) 1 2 3 4 5 6 7 8 (B) 二、用真核細(xì)胞表達(dá)和生產(chǎn)基因工程藥物 雖然用大腸桿菌細(xì)胞表達(dá)基因工程藥具有許多優(yōu)點(diǎn) ， 如成本低等 ， 但由于原核系統(tǒng)表達(dá)的真核基因蛋白有時(shí)缺乏生物活性 ， 其原因由于原核生物缺乏合適的轉(zhuǎn)譯后修飾機(jī)制 。 induced by IPTG。 of the lysate。 induced by IPTG。 F抗原純化與鑒定 離心后所得包涵體蛋白經(jīng)過初步純化和溶解后 ， 經(jīng)過親和層析柱 （ Ni2+charged IDA Hisbind column） 純化 ， 得到一分子量約為43kD的單一蛋白帶 （ 8） 。 表達(dá)載體 pET15bF 構(gòu)建示意圖 F抗原表達(dá) 經(jīng) IPTG誘導(dǎo)后，含表達(dá)載體 pET15bF的表達(dá)菌株表達(dá)出一外源蛋白，該蛋白大小在 43kD左右，與文獻(xiàn)報(bào)道大鼠 F蛋白大小一致。 提取大鼠肝臟總 RNA，對(duì)其進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄和 PCR（ RTPCR）擴(kuò)增出目的基因（ Fantigen’s cDNA），然后將其與 pET15b載體進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌 BL21(DE3)plyss，在含氨卞青霉素和氯霉素的培養(yǎng)基上篩選轉(zhuǎn)化子。 利用原核 （ 大腸桿菌 ） 表達(dá)系統(tǒng) ， 成功表達(dá)了大鼠肝臟 F抗原 ， 表達(dá)產(chǎn)物經(jīng) SDSPAGE， Westernblot分析 ， 分子量為 43kD， 同時(shí)具有 F抗原的免疫學(xué)活性 ， 可作為一種基因工程產(chǎn)品用于今后的免疫檢測工作 。 The method used to synthesize rebinant human insulin. 1915 溴化氰 例子 大鼠肝臟 F抗原 蛋白基因在大腸桿菌中表達(dá) F蛋白定位在肝細(xì)胞漿中 ， 正常人肝組織中的 F蛋白含量是血清中 1370倍 ， 只有肝細(xì)胞被破壞時(shí) ， F抗原才釋放到血漿中 ， 使血清中 F抗原含量升高 ， F抗原用作肝病診斷 ， 首先需獲得純的 F抗原 。 □ 胰島素是治療糖尿病的重要藥物 ， 之前從豬或牛的胰腺中提取分離 ， 含量少而且會(huì)有毒素 。 目前有幾十種基因工程藥物 ， 常用的有：干擾素 、 白細(xì)胞介素 、 乙肝疫苗 、 人胰島素和人生長激素等 。而且可以讓這些特殊功能的基因生產(chǎn)出具有特殊功能的蛋白質(zhì)藥物，這是目前 基因工程 領(lǐng)域中最活躍最有成果和極富商業(yè)價(jià)值的領(lǐng)域之一，究其原因： （ 1）蛋白質(zhì)和多肽是基因表達(dá)的直接產(chǎn)物，可用重組 DNA技術(shù)進(jìn)行研究和生產(chǎn)。 基因工程 □ 定義：根據(jù)分子生物學(xué)和遺傳學(xué)的原理，將一種生物的遺傳物質(zhì) DNA轉(zhuǎn)移到另一生物體中，使后者獲得新的遺傳性狀或表達(dá)出所需要的產(chǎn)物。 Sanger DNA 序列分析示意圖 DNA sequencing gel showing the separation of fragments in the four sequencing reactions (one per lane). In DNA sequencing using dideoxynucleotides labeled with fluorescent dyes, all four ddNTPs are added to the same tube, and during primer extension, all binations of chains are produced. 1620 Automated DNA sequencing using fluorescent dyes, one for each base. 思考題： 假定某一克隆基因的部分序列為5 ， —TCACGTAAGT—3 ， ， 試根據(jù)Sanger序列分析方法原理 畫出測定上述序列的放射自顯影示意圖 ， 并對(duì)示意圖作必要的標(biāo)注和解釋 。 如在加有 ddATP的反應(yīng)管中產(chǎn)生的是一系列以 A為結(jié)尾的寡核苷酸鏈；在加有 ddGTP的反應(yīng)管中形成的是以 G為結(jié)尾一組寡核苷酸鏈等等 ， 再經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳 、 轉(zhuǎn)膜和放射自顯影即可從放射自顯影膠片上讀出 DNA序列 。 重疊基因是利用兩種不同的讀碼框架編碼兩種不同的蛋白質(zhì)，在每一讀碼框中密碼子解讀仍是不重疊的。 如何解開這個(gè)謎 ？ Sanger回答了這個(gè)問題： 在基因組中存在重疊基因 ！ 重疊基因 定義：在一種蛋白質(zhì)的核苷酸編碼序列中包含了另一種蛋白質(zhì)的編碼序列，所不同的是各自以不同的讀碼框轉(zhuǎn)譯。 為此 Sanger第二次獲得諾貝爾獎(jiǎng) 。 思考：如何用分子雜交法 篩選和 鑒定一個(gè)野生型和一個(gè)突變型基因？ 第五節(jié) DNA序列分析 DNA序列分析是最終了解基因結(jié)構(gòu)和組成的重要工具 ,在人類基因組計(jì)劃中測定人基因組的全部核苷酸序列是該計(jì)劃的核心 。 □ 定義 :特異性地改變某一基因的方法稱 定點(diǎn)誘變 sitedirected mutagenesis 克隆基因的定點(diǎn)誘變 根據(jù)基因中欲改變位點(diǎn)的核苷酸序列設(shè)計(jì)一段引物，引物中含有突變的堿基。 三，克隆基因的定點(diǎn)誘變 □ 意義 ：基因的功能通常是通過其突變體來認(rèn)識(shí)其作用的。 思考題： 假定人生長激素基因的 cDNA(1kb)已經(jīng)插入在某一載體的 BamHI和 EcoRI的酶切位點(diǎn)中，該克隆大小為 5kb。 * 一個(gè)基因的 cDNA克隆和 genomic克隆可能在大小上有很大區(qū)別 ， 為什么 ？ 4． 直接分析克隆基因表達(dá)的蛋白 在生物的不同器官和組織，或在細(xì)胞的不同的分化階段會(huì)有某些特定基因的表達(dá)，此時(shí)細(xì)胞中的特定基因會(huì)特異性轉(zhuǎn)錄成特定蛋白的mRNA，因此可用反轉(zhuǎn)錄方法獲得該基因的cDNA。 The Southern blotting technique southern blot after hybridization, exposure, and development. The bands show DNA fragments plementary to the nucleotide sequence of the probe. 3． 用 cDNA克隆作探針 ， 從基因文庫中篩選目的基因克隆 。該方法可用于重組質(zhì)粒鑒定，轉(zhuǎn)基因生物中外源基因的插入位置，遺傳病的分子診斷等。 2． Southern Blotting 酶切和電泳只能對(duì)重組克隆作出初步鑒定，可得知克隆片段的大小但尚難確定克隆片段是否目的基因。 組成一個(gè)基因文庫的全部重組質(zhì)粒或全部重組噬菌體代表了一個(gè)生物整個(gè)基因組。 組成一個(gè)基因文庫的全部重組質(zhì)?；蛉恐亟M噬菌體代表了一個(gè)生物整個(gè)基因組 。 Shuttle Vectors 第四節(jié) 重組 DNA方法學(xué) 一 、 克隆戰(zhàn)略 1． 無選擇地從一個(gè)限制酶切的混合物中克隆全部片段 ， 然后再篩選所需的目的基因 。 4． 表達(dá)載體 Expression Vectors 具有合適的轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)譯起始信號(hào) ， 外源基因插入合適的區(qū)域后能夠表達(dá)的載體 。 分離這種復(fù)制型的雙鏈可用作克隆的載體 。 2． λ噬菌體 它的頭部通常能包裝進(jìn) 45kb 長的DNA分子 ， 基因組中間部分是裂解性生長的非必需區(qū) ， 因此在其區(qū)域內(nèi)轉(zhuǎn)換插入大的外源 DNA片段可以不影響其復(fù)制功能 。 A Petri plate showing the growth of bacterial cells after uptake of rebinant plasmids. 166 菌落原位雜交篩選和鑒定克隆的基因 根據(jù)重組質(zhì)粒中的目的基因的序列，合成一段與之互補(bǔ)的 DNA序列，并使其標(biāo)記上放射性同位素，該段 DNA稱為探針。 當(dāng)外源基因插入到多克隆位點(diǎn)區(qū)后就阻斷了 Lac Z基因的編碼區(qū)，使 Lac Z基因失去了功能，因此，凡是插入了外源基因的重組質(zhì)粒進(jìn)入宿主細(xì)胞后，這些細(xì)胞就不能利用 Xgal，結(jié)果在培養(yǎng)基上形成 白色的菌落。 A colorenhanced electron mincrograph of circular plasmid molecules isolated from the bacterium . .The plasmid pUC18 offers several advantages as a vactor for cloning Cloning with a plasmid vector. 169 利用 Lac Z基因的插入失活篩選重組子 許多載體的多克隆位點(diǎn)區(qū)插入在Lac Z基因區(qū)中。 （ 3） 具有易于篩選重組分子的標(biāo)志 ， 如抗藥性 。 EcoRI ↓ C C G A A T T C G G EcoRI G G C T T A A G C C 人工接頭 ↑ EcoRI ＋ T4DAN 連接酶 人工接頭 EcoRI 外源 DNA 粘性末端用于連接載體 人工接頭的應(yīng)用 四 、 載體 Vectors 能使克隆的片段不斷復(fù)制的一類 DNA分子稱載體 ， 應(yīng)具備以下特點(diǎn)： （ 1） 分子量小 ， 核苷酸序列清楚 ， 具有一些單一酶切位點(diǎn)或人工插入的多克隆位點(diǎn)區(qū) 。 缺點(diǎn)：加入的 polyA和 polyT可能影響基因表達(dá)；外源基因克隆擴(kuò)增后不能用限制酶重新從重組質(zhì)粒中切出來 。 一 、 直接產(chǎn)生粘性末端用于組成一個(gè)新的重組DNA分子 （ rebinant DNA） 162 二 、 加尾連接 （ Tailing） 1． 同聚物加尾