hxy-第四章-目的基因的獲取-wenkub
2023-05-22 18:09:15 本頁面
【正文】 ② 內(nèi)切酶粘性末端 能與常用克隆位點相連。 （ 1）限制性內(nèi)切酶的選用原則 1） 4bp的內(nèi)切酶 平均每 46（ 4096） bp一個切點。 酶切 由于帶有粘性末端，產(chǎn)物可以直接與載體連接。 基因克隆的本質(zhì)是把某一目的 DNA片段通過無性方式進行擴增和表達(dá)，而這一過程往往是通過載體和寄主細(xì)胞來實現(xiàn)的。 一般而言，基因克隆包括四部分工作： 目標(biāo) DNA片段的獲得； 克隆載體的構(gòu)建； 寄主細(xì)胞的轉(zhuǎn)化； 重組體克隆的選擇和鑒定 。 1. 優(yōu)點 2. 缺點 目的基因 內(nèi)部 也可能有該內(nèi)切酶的切點。 2） 6bp的內(nèi)切酶 平均每 44（ 256） bp一個切點。 （ Sau3A— BamH I） 2. 機械切割法 （ 1）超聲波 超聲波強烈作用于 DNA，可使其斷裂成約 300bp的隨機片斷。 化學(xué)合成的 DNA片斷一般在 200bp以內(nèi)。 3’ 5’ 5’ 3’ 5’ 3’ T4DNA連接酶 Klenow片段 引物 1. 直接合成基因 三、 寡聚核苷酸化學(xué)合成的優(yōu)點 2. 合成引物（ 20mer左右） （ 1） mRNA的含量很低，很難作 cDNA 3. 合成探針序列 4. 定點突變合成 合成帶有 定點突變 的基因片斷。 一、基因文庫的構(gòu)建 1. 基因文庫（ gene library） 第三節(jié) 目的基因的保存和擴增 （ 2） 目前常用的載體 2. 構(gòu)建基因文庫的載體選用 載體能夠容載的 DNA片斷大小直接影響到構(gòu)建完整的基因文庫所需要的 重組子 的數(shù)目。 （ 1）染色體 DNA大片段的制備 3. 基因文庫構(gòu)建的一般步驟 超聲波（ 300bp）或機械攪拌（ 8kb）。 如： Sau3A與 BamHI的酶切末端。 接上人工接頭 粘性末端 CCC CCC 末端轉(zhuǎn)移酶 粘性末端 ③ 同聚物加尾 4. 基因組文庫的大小 一個文庫要包含 99%的基因組 DNA時所需要的克隆數(shù)目。 （ 2）可以在細(xì)菌中直接表達(dá)。 分離 mRNA用商業(yè)化的 Oligo dT纖維柱。 用 Oligo dT（或隨機引物）作引物，合成 cDNA的第一鏈。 cDNA第一鏈 5’ cDNA第二鏈合成 DNA聚合酶 cDNA第一鏈 cDNA第二鏈 5’ 3’ ③ cDNA第二鏈合成 這種酶能識別 mRNAcDNA雜交分子中的mRNA，并將其降解成許多小 片斷 。 cDNA第一鏈 cDNA第二鏈 5’ 3’ cDNA第一鏈 cDNA第二鏈 5’ 3’ 5’ 3’ 在雙鏈 cDNA末端接上 人工接頭 ，即可與載體連接，轉(zhuǎn)入受體菌。 文庫 載體 探針 電泳后雜交放射自顯影 測序分析 第四節(jié) 目的基因的分離和擴增 一、目的基因的分離 1. 探針柱分離特異 mRNA 根據(jù)已知的基因序列合成探針，結(jié)合到 纖維素柱 上，用來分離純化該基因
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